La progression des cellules dans le cycle cellulaire est gouvernée par une famille de complexes à activité protéine kinase : les complexes CDK/cycline. L'activité de ces complexes est régulée notamment par la déphosphorylation activatrice de résidus tyrosine et thréonine par les phosphatases à double spécificité CDC25. Trois phosphatases CDC25 ont été identifiées dans les cellules de mammifères, et lors de notre travail, nous avons étudié la phosphatase CDC25B. Dans les cellules d'adénocarcinome humain (HeLa), nous avons montré que CDC25B présente une localisation nucléaire ou cytoplasmique stricte ou pan cellulaire, suggérant un trafic nucléo-cytoplasmique actif. Par des approches de mutagenèse dirigée et d'expression transitoire de la protéine sauvage ou mutante, nous avons identifié un signal de localisation nucléaire (NLS) et d'export nucléaire (NES) fonctionnels, et montré que la rétention cytoplasmique de CDC25B nécessite son interaction avec les protéines 14-3-3. Afin de caractériser les mécanismes régulant la fonction de CDC25B in vivo, nous avons entrepris la recherche de nouveaux partenaires de cette phosphatase. Partant d'observations biochimiques : la phosphorylation in vitro de CDC25B par la protéine kinase Eg3, nous avons établi que ces deux protéines interagissent in vivo, dans une lignée surexprimant de manière conditionnelle CDC25B. Une collection de protéines mutantes de CDC25B, nous a permis d'identifier (i) le site d'interaction avec la protéine kinase Eg3, (ii) un site de phosphorylation. Aucune modification de l'activité phosphatase de CDC25B, phosphorylée par Eg3 n'est observée in vitro. Cependant, nous avons montré in vivo, par une analyse en cytométrie de flux, que l'expression de CDC25B est capable d'annuler l'accumulation des cellules en phase G2 induite par la surexpression de Eg3. Ces derniers résultats suggèrent fortement une interaction fonctionnelle entre CDC25B et Eg3, dont les mécanismes in vivo restent à préciser. L'isolement de nouveaux partenaires protéiques de CDC25B a été entrepris par leur co-purification grâce à l'utilisation de lignées U2OS exprimant HA-CDC25B de manière conditionnelle, ou de protéines recombinantes MBP-CDC25B. Certains problèmes techniques ne nous ont pas encore permis d'isoler des partenaires, mais les derniers résultats sont prometteurs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00010040 |
| Date | 18 December 2001 |
| Creators | Davezac, Noélie |
| Publisher | Université Paul Sabatier - Toulouse III |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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