Die Entdeckung der RNA‐Interferenz (RNA‐i) als ein natürlicher Prozess der Genregulation sorgte auf Grund des möglichen Einsatzes für therapeutische Zwecke für großes Interesse. Probleme beim Transport der RNA‐i‐induzierenden kleinen RNA‐Moleküle (siRNAs) traten vor allem hinsichtlich Ladungsverhältnissen, Instabilität und Molekulargewicht auf. Um diese Probleme zu lösen, wurden zunehmend Transportsysteme aus Nanopartikeln untersucht. Die verwendeten Polyethylenimine (PEIs) sind positiv geladene, verzweigt oder linear aufgebaute Polymere, welche mit RNAs (siRNA, miRNA) Komplexe bilden. Modifikationen der PEI‐Kom‐ plexe können zu einem effektiveren Transport der RNA, zu veränderten pharmakokinetischen Eigenschaften und zu einer verbesserten Biokompatibilität führen. Der Erfolg dieser therapeu‐ tischen Nanopartikel ist insbesondere von der effizienten zellulären Aufnahme, der Fähigkeit der Gewebepenetration und vom Erreichen der Zielzellen abhängig. Der Großteil der bisheri‐ gen Untersuchungen von PEIs wurde an Zellkulturen durchgeführt. Die hier erzielten Ergeb‐ nisse lassen sich jedoch nur schwer auf komplexe in‐vivo‐Systeme übertragen.
Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Anwendung der PEIs an Tumorschnitt‐ kulturen untersucht. Dafür wurde zuerst die Kultivierung von 350 μm durchmessenden Dünn‐ schicht‐Präparaten von Xenotransplantat‐Tumoren aus PC3 und U87 Zelllinien etabliert. Eine erfolgreiche Kultivierung konnte über 14 Tage durchgeführt werden. An bestimmten Zeit‐ punkten nach Kultivierungsbeginn (Tag 1, 3, 5, 7 und 14) wurden die Morphologie und die Vitalität (Apoptose, Proliferation) durch eine HE‐ oder immunhistochemische Färbung be‐ stimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Morphologie der Tumorzellen sowie die Prolifera‐ tion und Apoptose über den gesamten Kultivierungszeitraum erhalten blieben.
Im nächsten Schritt wurde sowohl der Transport der siRNA von nicht‐modifizierten und modi‐ fizierten PEIs als auch der Transport durch deren Lipopolyplex‐Derivate (PEI‐siRNA‐Komplexe mit Liposomenhülle) analysiert. Für die Visualisierung der Komplexe wurde fluoreszenzmar‐ kierte siRNA verwendet. Die PEI‐siRNA‐Komplexe wurden auf die Schnittkulturen gegeben und über 24 Stunden kultiviert. In der mikroskopischen Analyse und ihrer Quantifizierung erfolgte die erste Einschätzung der Gewebepenetration. Es zeigten sich Unterschiede in der Gewebe‐ penetration der verschiedenen Nanopartikel, abhängig von deren Oberflächenladung.
Um die biologische Aktivität der Nanopartikel in lebenden Zellen besser evaluieren zu können, wurde im dritten Schritt der Knockdown eines endogenen Genproduktes untersucht. Zielgen war hier das Onkogen Survivin, welches ein wichtiger endogener Überlebensfaktor der Tu‐ morzellen darstellt. Es gelang der Nachweis eines durch PEI‐siRNA‐Komplexe vermittelten Knockdowns des Survivin‐Gens.
Insgesamt konnten somit Gewebeschnittkulturen als Grundlage für die ex‐vivo Untersuchung von Nanopartikeln etabliert werden. Es konnten nicht nur Aussagen über die Gewebepenet‐ ration der Nanopartikel, sondern auch über ihre biologischen Aktivitäten in einer intakten Ge‐ webestruktur getroffen werden.:Bibliographische Beschreibung 3
1 Einleitung 5
1.1 Der Einsatz der RNA-Interferenz (RNA-i) und von Nanopartikeln in der Medizin 5
1.2 Die RNA-Interferenz 6
1.2.1 Der Prozess der RNA-Interferenz 6
1.2.2 Vor- und Nachteile der RNA-Interferenz 9
1.3 Nanopartikel als Transportsysteme der siRNA: Polyethylenimine 10
1.4 Die Transportfähigkeit von Polyethyleniminen und ihre Optimierung 12
1.5 Anwendung der Polyethylenimine in in-vivo-Systemen 14
1.6 Präklinische Tumormodelle 15
1.6.1 Zellkulturen 15
1.6.2 Xenograft-Modelle und Gewebeschnittkulturen 16
2 Fragestellung 18
3 Literatur 19
4 Publikationen 24
5 Anlagen 32
6 Zusammenfassung und Ausblick 33
7 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 36
8 Lebenslauf 37
9 Danksagung 40
10 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag 41
11 Teilnahmebestätigung: Vorlesung zur „Guten Wissenschaftlichen Praxis“ 42
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:39017 |
| Date | 01 April 2020 |
| Creators | Merz, Lea Maria |
| Contributors | Höbel, Sabrina, Merz, Felicitas, Kallendrusch, Sonja, Bechmann, Ingo, Aigner, Achim, Schöneberg, Torsten, Köhl, Ulrike, Universität Leipzig, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German, English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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