L’activitat de la plasmina és clau en el procés de regeneració muscular després
d’una lesió. Aquesta proteasa d’ampli espectre de substrat afavoreix l’eliminació de
fibrina i col∙lagen extracel∙lulars, i indueix la migració de cèl∙lules del sistema
inflamatori a l’àrea danyada, però no es coneix si afecta a les cèl∙lules musculars
directament. Estudis previs del grup han identificat l’alfa‐enolasa com a principal
receptor del plasminogen en els mioblasts murins i han determinat que la generació i
focalització de l’activitat proteolítica de la plasmina a través d’alfa‐enolasa a la
superfície dels mioblasts és clau pel procés de miogènesi i regeneració muscular.
En aquesta tesi, inicialment s’ha determinat la unió del plasminogen i de la
plasmina a la superfície dels mioblasts murins C2C12 i dels cultius primaris de MPCs
(Muscle Precursor Cells), i s’ha confirmat la implicació de l’alfa‐enolasa com a principal
receptor del plasminogen involucrat. Per fer‐ho s’ha generat un anticòs específic per la
isoforma alfa‐enolasa que inhibeix la seva unió al plasminogen. Els estudis realitzats
amb aquest nou anticòs, anomenat MAb872, no només han confirmat l’alfa‐enolasa
com a principal receptor involucrat en la unió del plasminogen als mioblasts sinó que
han demostrat que la inhibició de la unió alfa‐enolasa/plasminogen impedeix la
diferenciació i fusió miogènica dels mioblasts murins in vitro i in vivo.
Seguidament, s’ha observat que la presència de plasmina unida a la membrana
dels mioblasts a través d’alfa‐enolasa indueix l’activació de les vies MAPK/Erk i
PI3K/Akt de forma depenent de la seva activitat proteasa. L’alfa‐enolasa no posseeix
un domini transmembrana i es desconeix com es localitza a la membrana plasmàtica.
La manca de domini intracel∙lular de l’alfa‐enolasa, suggereix la participació de
receptors col∙laboradors per poder transduir la senyal a l’espai intracel∙lular. Entre
diversos receptors candidats analitzats, observem indicis de la participació de les
integrines β1/β3 i l’activació de la via MAPK/Erk a través de Src i FAK. A nivell cel∙lular,
la unió de la plasmina als mioblasts provoca canvis en la reorganització del
citoesquelet d’actina afavorint la desadherència del substrat i induint la migració
cel∙lular. Alhora s’ha demostrat que l’activació de la via PI3K/Akt en presència de
plasmina incrementa la supervivència dels mioblasts en situacions d’estrès cel∙lular.
Per altra banda, seguint indicis previs del grup que suggerien la participació de
EGFR en el procés miogènic, s’ha analitzat l’expressió de EGFR en el múscul esquelètic
d’animals wt i animals distròfics mdx, així com durant el procés de regeneració in vivo i
el procés de miogènesi in vitro. Els resultats obtinguts mostren una molt baixa
expressió i activació de EGFR en el múscul esquelètic adult i un notable increment
després d’una lesió muscular o en un múscul adult distròfic. L’anàlisi in vitro ha permès
determinar la participació de EGFR en la proliferació i supervivència dels mioblasts i la
pèrdua de l’expressió d’aquest receptor a l’inici del procés miogènic. També s’ha
observat que la inhibició de l’activitat tirosina quinasa de EGFR estimula la fusió
miogènica obtenint més fibres musculars i de major tamany. Aquests resultats
suggereixen la inhibició de EGFR com a possible diana terapèutica per estimular els
processos miogènics en situacions patològiques, com és el cas de la distròfia muscular
de Duchenne. Estudis preliminars de l’administració de AG1478, inhibidor de l’activitat
tirosina quinasa de EGFR, en animals mdx indiquen que AG1478 podria millorar el
fenotip distròfic d’aquests animals. / Plasmin activity is necessary for muscle regeneration process after an injury. This
broad‐spectrum protease is the major enzyme responsible for the dissolution of fibrin
and most of the components of ECM and it also promote and lead the migration of
inflammatory cells to injured area. However, it is unknown if it plays also a role in
muscle cells directly. Pervious results of the group identified alpha‐enolase as the
major plasminogen receptor in murine myoblast. Our group also described alphaenolase
dependent generation and focalization of plasmin on the myoblasts surface as
an essential event in myogenesis and muscle regeneration process.
Firstly, in this thesis we have analyzed the capacity of murine myoblast (C2C12 and
primary culture of Muscle Precursor Cells or MPCs) to bind plasminogen and plasmin in
an alpha‐enolase dependent way, as well the participation of alpha‐enolase in
myogenic process. In order to address this question we generated a monoclonal
antibody (MAb872) that inhibits plasminogen binding to alpha‐enolase. The results
using this antibody corroborate the role of alpha‐enolase as a major plasminogen
receptor in myoblast and confirm the impairment of satellite‐cells‐derived myoblast
differentiation and fusion in vitro and in vivo, when alpha‐enolase/plasminogen
interaction is abrogated.
We further observed plasmin binding to alpha‐enolase induces MAPK/Erk and
PI3K/Akt pathways in a plasmin activity dependent way. It is unknown how alphaenolase
reaches the membrane as it lacks transmembrane domain. Moreover, the
absence of intracellular domain suggests that alpha‐enolase collaborates with other
receptors to transduce plasmin‐dependent signaling. Among several receptors, we
have identified the participation of integrins β1/β3 in the plasmin‐induced MAPK/Erk
signaling upstream Src and FAK in myoblasts. The cellular effect of plasmin binding to
alpha‐enolase is the reorganization of actin filaments promoting cellular migration.
Moreover plasmin activation of PI3K protects murine myoblast from apoptosis in stress
conditions suggesting a protective role of this protease.
Other previous results in our group suggested the participation of EGFR in
myogenic process as well. To address this hypothesis we have analyzed the expression
of EGFR in skeletal muscle from wt mice, dystrophic mdx mice and in cardiotoxininjured
mice, as well as during myogenesis in vitro. Our results show a reduced basal
expression and activation of EGFR in adult non‐injured muscle but high levels of active
EGFR in injured and dystrophic muscle. In vitro analysis has revealed that EGFR
participates in proliferation and surviving of non‐diferentiated myoblasts and the
inhibition and downregulation of EGFR at the beginning of differentiation process.
Moreover, EGFR inhibition with AG1478 induces myoblasts differentiation and fusion
generating bigger muscle fibers. These results point the inhibition of EGFR as a
therapeutic tool in deficient myogenic process as in dystrophic muscles. Preliminary
work administrating AG1478 in mdx mice suggest a possible therapeutic effect of this
EGFR inhibitor.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/285134 |
| Date | 02 December 2014 |
| Creators | Roig Borrellas, Anna |
| Contributors | López Alemany, Roser, Farrés i Vicén, Jaume, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 304 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.003 seconds