Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein
inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs,
welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von
Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2-
defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie,
sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2-
Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle,
sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen
der Mitochondrien gekennzeichnet.
Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu
beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte
Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese
Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären
Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein
könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher
Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen
abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an
Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende
(E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2-
KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5-
Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das
Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als
Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die
Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten
Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des
lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich
in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als
Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die
Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht.
Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine
Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt.
Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel
durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat
zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von
SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins
VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer
verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der
Vesikel in Einklang bringt.
Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System
durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen
Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen
werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und
das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2-
defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine
gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt. / The Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) is a MAP kinase
signaling inhibitor working downstream of Ras. It has a critical influence on regulating
proliferation, differentiation, expression of proteins and cellular hemostasis. The
cardiac phenotype of SPRED2 deficient mice not only shows a significant left
ventricular hypertrophy but also a hightened fibrosis of the heart tissue. On the cellular
level the SPRED2 deficiency is marked by an accumulation of ventricular structures
within the cell, as well as a decisive number of vesicles along the longitudinal rows of
mitochondria.
The aim of this work was to elucidate the properties of these vesicular structures
and to determine in which context the subcellularly modified architecture and the
hypertrophy of the SPRED2 deficient animals stand to each other. To answer this
question, a protein degradation mechanism that could be changed within the SPRED2
deficient cardiomyocytes was identified. Macroautophagy, further called autophagy, is
such a degradation mechanism, which degrades long-lived proteins and cell
organelles. This work identified significant changes made to the protein level of key
regulators of autophagy. The ubiquitin-activating (E1) enzyme homolog Atg7 as well
as the cystein protease Atg4B are reduced in the SPRED2 KO. Similarly, Atg16L,
which acts as an essential part of the Atg5-Atg12-Atg16 conjugation system in the process of conjugating MAPLC3 to the phospholipid phosphatidylethanolamine. The
autophagic flux, as the relation between conjugated and unconjugated MAPLC3, is
reduced in the knockout as well. The accumulation of autophagic vesicles is in
accordance with the elevated protein levels of the cargo receptors SQSTM1 and NBR1
as well as the lysosomal marker CathepsinD. Besides the reduced autophagic flux
there is an elevated protein level of activated caspase-3 as a marker of apoptosis. To
further elucidate the mitochondrial integrity, the endogenous levels of reactive oxygen
species were determined in wildtype and knockout individuals. It was shown that the
SPRED2 knockout contains an elevated level of ROS which could be a sign of reduced
mitochondrial survival.
Finally, it was investigated whether the disturbed transport of vesicles was due to
impaired motor protein efficiency. It was shown that the activity of the dynein ATPase
was reduced when SPRED2 was absent. This observation is supported by the elevated
levels of the vSNARE protein VTI1b, which connects the accumulation of autophagic
vesicles with the reduced ability to membrane fusion and a less efficient transport of
vesicles.
The experiments of this work were conducted in a global SPRED2-KO system.
Possible effects of the changed hormonal situation of the SPRED2 deficient animals
to the heart phenotype cannot be excluded. For that reason a conditional SPRED2
knockout mouse line with conditional potential was created capable of further
elucidating the effect of a SPRED2 deficiency to the heart.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:18270 |
| Date | January 2019 |
| Creators | Röser [geb. Aßmus], Benjamin |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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