Proteínas e peptídeos ricos em glicina são encontrados em animais e plantas. Alguns apresentam atividade antimicrobiana. Como pouco se sabe sobre suas síntese, estrutura, relação estrutura-atividade e mecanismo de ação, tais tópicos foram estudados para os antimicrobianos cheferina I (Chef I) e/ou fragmentos da acantoscurrina (acanto). No que se refere à Chef I (67,9% de Gly, 28,6% de His, seis repetições do motivo GGH e uma Tyr), sintetizamos, purificamos, caracterizamos e testamos Chef I, os seus análogos truncados na(s) porção(ções) N- ou/e C-terminal (is) e os análogos amidados Chef la, Chef I (3-28)a e Chef I (6-28)a. Os três últimos e Chef I foram igualmente ativos frente a cepas de C. albicans (MIC: 12,5 µM), mas não frente a cepas de C. tropicalis e S. cerevisiae. A amidação tornou o análogo Chef I (3-28)a mais ativo frente a tais cepas. Enquanto as atividades antifúngicas de Chef la e de seus análogos foram reduzidas pelo aumento da força iônica, elas foram aumentadas em presença de ZnCl2 5-10 µM. A 62,5 µM a Chef la foi letal para C. albicans MDM8. Ela foi pouco hemolítica em tampão fosfato contendo NaCl ou em tampão glicose fosfato isotônico (100 µM: 18%). Análises por microscopia confocal e citometria de fluxo revelaram que Chef la marcada com carboxifluoresceína (FAM-Chef la) foi rapidamente internalizada nas células de C. albicans MDM8, um processo que não foi afetado pela força iônica do meio e se mostrou dependente de ATP e temperatura. Quanto aos fragmentos da acanto (proteína com 132 aminoácidos, 73% de Gly e 3 repetições de uma seqüência de 26 aminoácidos), estudamos a síntese em fase sólida dos fragmentos N- e C-terminais, acanto (1-22) e acanto (101-132) , respectivamente, e da porção repetitiva, acanto (23-48). Apesar de uma predição teórica não ter indicado alto potencial de agregação para a acanto, as sínteses foram problemáticas: a ocorrência de aminoacilações incompletas repetitivas a 60° C usando diferentes estratégias, resinas, reagentes acopladores, solventes e sais caotrópicos sugeriram a ocorrência de agregação das cadeias peptídicas em crescimento sobre as resinas O uso da resina CLEAR amida permitiu a obtenção do acanto (113-132). Tentativa de síntese convergente em fase sólida não foi bem sucedida. Espectros Raman das peptidil-resinas obtidas confirmaram a presença de estruturas em folha β pregueada. Somente o uso combinado de resina CLEAR amida, 60°C, 20% DMSO/NMP, Fmoc-(Fmoc-Hmb)Gly-OH e LiCI permitiram a síntese total de acanto (101-132) . O uso da resina CLEAR ácida permitiu a síntese do fragmento acanto (23-48) e acanto (10-22) , esta última durante a tentativa de síntese do acanto (1-22) . Os rendimentos foram baixissimos e os espectros Raman das peptidil-resinas correspondentes também indicaram a formação de folhas β pregueadas. Estes resultados indicaram que Chef I (3-28)a mimetiza Chef I, que Chef la é um fungicida potente com alvo intracelular, que a internalização do seu análogo marcado na célula de levedura ocorra via endocitose, que a Chef la tem potencial para agir como uma droga de uso tópico e que os fragmentos de acanto são \"difficult sequences\" típicas. / Proteins and peptides with high content of glycine have been found in animais and plants. Some of them display antimicrobial activity. As little is known about their chemical synthesis, structure, structure-activity relationship and mode of action, we studied such topics using shepherin I (Shep I) and fragments of acanthoscurrin (acantho) as targets. Concerning to Shep I (67.9% of Gly, 28.6% of His, six direct repeats of the motif GGH and one Tyr), we synthesized, purified, characterized and tested Shep I, its analogues truncated at the N- and/or C-terminal portions and the amidated analogues Shep la, Shep I (3-28)a and Shep I (6-28)a. The last three analogues and Shep I were equally active against C. albicans (MIC: 12.5 µM) strains, but not against C. tropicalis and S. cerevisiae strains. Cterminal amidation made Shef I (3-28)a more active against those fungai strains. Anticandidal activities of Shep la and truncated analogues were inhibited in high ionic strength solutions, but enhanced at 10 µM ZnCI (2 to 8-fold). At 62.5 µM (5 MIC), Shep la killed C. albicans MDM8 in 30 mino It caused low hemolysis in phosphate buffered saline and isotonic glucose phosphate buffer (100 µM: 18%). Confocal microscopy and flow cytometry analyses revealed that Shep I modified with carboxyfluorescein (FAM-Shep la) was rapidly internalized into C. albicans MDM8 cells, process not affected by ionic strength and showed to be energy and temperature-dependent. As to the fragments of acantho (a protein with 132 amino acids, 73% of Gly, and three repeats of 26 amino acids), we studied solid-phase syntheses of the N- and C-terminal portions, acantho (1-22) and acantho (101-132), respectively, and of the repetitive portion, acantho (23-48). A theoretical prediction did not indicate high aggregation potential for acantho, but solid-phase syntheses were troublesome: repetitive incomplete aminoacylations took place even at 60°C using different strategies, resins, coupling reagents, solvents and chaotropic salts, suggesting aggregation of the growing peptide chains. Change to CLEAR amide resin allowed obtaining acantho (113-132) . Attempt using convergent solid phase synthesis was not successful. Raman spectra of the growingpeptidyl-resins revealed pleated β-sheet structures. Only the combination of CLEAR amide resin, 60°C, 20% DMSO/NMP, Fmoc-(Fmoc-Hmb)Gly-OH and LiCl allowed the total synthesis of acantho (101-132). The use of CLEAR acid resin also allowed obtaining the fragments acantho (23-48) and acantho (10-22), the last one during the attempt of the synthesis of acantho (1-22). The synthesis yields were extremely low and, again, the Raman spectra of the growing peptide-resins indicated the occurrence of pleated β-sheet structures. Altogether, the results indicated that Shep l (3-28)a mimics the fungicidal activity of Shep l, Shep la is a potent anticandidacidal peptide that has an intracellular target, FAM Shep la may be internalized into the fungai cells via endocytosis, Shep la has the potential to act as a drug for topical use and acantho fragments are typical difficult sequences.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-18072016-110317 |
| Date | 06 February 2009 |
| Creators | Cesar Manuel Remuzgo Ruiz |
| Contributors | Maria Teresa Machini, Sirlei Daffre, Regina Lúcia Baldini, Carlos Bloch Junior, Clovis Ryuichi Nakaie, Shirley Schreier |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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