Die einzellige Grünalge C. reinhardtii dient als Modellorganismus und ist aufgrund des GRAS-Status, des schnellen, kostengünstigen Wachstums und der Möglichkeit posttranslationaler Modifikationen im Kerngenom, als Expressionssystem für beispielsweise orale Impfstoffe sehr interessant. Herausforderungen sind die im Vergleich zu konventionell verwendeten Expressionssystemen sehr geringen Expressionsraten im Kerngenom. Daher sollten in dieser Arbeit neuartige, teils induzierbare, Promotorkonstrukte verwendet und mittels Luciferase-Reporter auf ihre Expressionssteigerung hin getestet werden. Zunächst wurden ausgewählte Promotoren des Chlorella-Virus-1 (PBCV-1) gewählt, diese führten allerdings zu keiner Expression. Außerdem wurden synthetische, aneinandergereihte Hitzeschockelemente mit dem endogenen RBCS2-Promotor fusioniert und die Expressionsraten analysiert. Dabei ergab sich bei der Kombination aus dem synthetischen Hitzeschockelement in achtfacher Wiederholung (HSE8x) mit RBCS2 nach der Hitzeinduktion eine Steigerung der Expressionsrate um das bis zu dreifache. Die Basalexpression war hierbei bei HSE1x-RBCS2 am höchsten und erreichte Expressionslevels, welche um das fünffache höher lagen als die Positivkontrolle HSP70A-RBCS2. Mittels Chromatinimmunopräzipitation mit dem Antikörper gegen HSF1 konnte gezeigt werden, dass eine Bindung an das synthetische Hitzeschockelement vorliegt und deshalb die Expression über die konventionelle Hitzeschockantwort in Chlamydomonas reinhardtii funktioniert. Im Gegensatz zur Luciferase benötigen Fluoreszenzproteine als Reporter kein Substrat. Infolge dieses Vorteils und der Möglichkeiten der FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie wurde tagRFP als neuer Reporter in C. reinhardtii etabliert. Die Erhöhung der Expressionsrate durch neue Promotorkombinationen und die Anwendung von tagRFP als neuen Fluoreszenzreporter bedeuten wichtige Schritte in der Etablierung von C.reinhardtii als Expressionssystem für Produkte in der Biotechnologie. / The unicellular green alga C.reinhardtii which is used as a model organism could be an interesting expression system for oral vaccines. This is because the alga is generally regarded as safe, it shows fast growth rates and culturing is cheap. Furthermore it offers the possibility of posttranslational modifications. Challenges lie in the low expression rates in the nuclear genome when compared to other expression systems. Therefore the first step in this work was to test whether selected Chlorella virus PBCV-1 promoters, do lead to enhanced expression rates, but there was no detectable expression. Furthermore synthetic repeats of heat shock elements were used in combination with the endogenous RBCS2-promoter and analysed for expression rates via reporter measurements. The combination of synthetic heat shock elements in eightfold repeats in combination with RBCS2 enhanced expression rates of luciferase after heat shock up to threefold in comparison with the up to now strongest known promoter combination HSP70A-RBCS2. Basalexpression turned out to be best for the HSE1x-RBCS2 promoter and reached expression levels fivefold higher compared to HSP70A-RBCS2. To examine if the artificial heat shock elements (HSEs) are bound by the heat shock factor 1 in C. reinhardtii a ChIP assay with HSE8x-RBCS2 and the antibody of HSF1 of C. reinhardtii was done. It could be shown that HSF1 binds HSEs and therefore one can explain the heat shock inducibility of HSEs is regulated via the conserved heat shock response. In contrast to luciferase fluorescence reporters do not need substrate. Because of this advantage and the possibility of FACS analyses and fluorescence microscopy tagRFP was established as new reporter in C.reinhardtii. Enhancement of expression rates through new constitutive and inducible promoter combinations and the possible use of tagRFP as new fluorescence reporter are significant steps in establishing C.reinhardtii as expression system for products in biotechnology.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/18043 |
| Date | 29 December 2015 |
| Creators | Kirchmayr, Anna |
| Contributors | Hegemann, Peter, Griesbeck, Christoph, Kühn, Kristina |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Lebenswissenschaftliche Fakultät |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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