L’objectif de cette thèse était d’isoler de nouvelles glycoside-hydrolases à partir d’une souche de Bacillus issue d’un Biotope sud-tunisien. Cette souche a montré des potentialités à produire une amylase et une lichenase à 45°C et à pH 9. La production de ces deux hydrolases a été optimisée en fermentation solide sur millet, une agro-ressource de faible coût. Cette optimisation a été conduite en adoptant la méthodologie des plans d’expériences. Nous avons ainsi obtenu des niveaux de production de l’ordre de 540 Unités d’activités amylase par gramme de substrat solide et 503 U/g d’activité lichenase. Ces deux protéines ont été par la suite purifiées et caractérisées biochimiquement. L’amylase présente un pH et une température d’activité optimaux de 5 et 70°C, respectivement. La lichenase a montré une thermoactivité et une thermostabilité remarquables qui la distinguent des lichenases précédemment décrites. En effet, l’enzyme conserve plus de 20% de son activité à 100°C, et plus de 60% de son activité après une incubation de 30 min à 90°C. Le gène codant pour cette protéine a été isolé par la construction d’une banque fosmidique dans E. coli. La comparaison de sa séquence avec la banque de données NCBI a montré que le gène de la lichenase UEB-S possède une très forte homologie avec celle de Bacillus subtilis 168, avec les positions de deux acides aminés seulement qui divergent. Un modèle de la lichenase construit au cours de cette étude laisse supposer que l’un de ces deux acides aminés (Val 69) pourrait être impliqué dans sa thermostabilité, et ce en modifiant la géométrie du site de fixation au calcium / The aim of this thesis was to isolate new glycoside hydrolases from a Bacillus strain isolated from a Biotope in the south of Tunisia. This strain was able to produce a lichenase and an amylase at 45 ° C and pH 9. The production of these two hydrolases was optimized in solid state fermentaion using millet, a low cost. agro-resource as solid substrate. This optimization was carried out using response surface methodology (RSM) based on Doehlert design. We obtained production levels of around 540 units of amylase activity per gram of solid substrate and 503 U / g of lichenase activity.Both proteins were subsequently purified and characterized biochemically. The amylase has a pH and a temperature optimum of activity of 5 and 70 ° C, respectively. The lichenase showed a remarkable thermostability which distinguish it from described lichenases. Indeed, the enzyme retained more than 20% of its activity at 100 ° C, and more than 60% of its activity after incubation for 30 min at 90 ° C. The gene encoding this protein was isolated by the construction of genomic a library in E. coli. Comparison of its sequence with the NCBI database showed that the gene coding for UEB-S lichenase has a very high homology with that of Bacillus subtilis 168, with a difference in the position of only two amino acids A model for UEB-S lichenase built during this study suggests that one of these two amino acids (Val 69) could be involved in its thermostability probabely by changing the geometry of the calcium binding site
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013ISAT0004 |
| Date | 18 February 2013 |
| Creators | Maktouf, Sameh |
| Contributors | Toulouse, INSA, Université de Sfax (Tunisie), Ellouz Chaabouni, Semia, Remaud, Magali |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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