Integrinas são glicoproteínas transmembrânicas envolvidas na adesão célula-célula e célula-proteina da matriz extracellular (ECM) que participam da migração e fusão de células trofoblásticas gigantes (TGC) com células do epitélio materno no placentoma bovino e interagem com inibidores teciduais de metalloproteinases (TIMPs), considerados importantes reguladores das metaloproteinases de matriz (MMPs), que são reconhecidas como passo limitande para ação de enzimas que atuam no remodelamento da ECM na implantação e na gestação. Uma vez que as integrinas são consideradas responsáveis pela manutenção da arquitetura tecidual e que as MMPs podem regular a degradação e a reconstituição da ECM necessária para a invasão do trofoblasto, temos como objetivo verificar uma possível relação das integrinas com alterações placentárias comumente observadas em gestações de animais clonados (SCNT). Para avaliar a funcionalidade placentária, a expressão do lactogênio placentário (PL) e do antígeno Ki-67 foram também verificadas. Placentomas bovinos foram coletados e divididos em 3 grupos: 1) início (n = 6) e 2) final (n = 3) da gestação de animais derivados de monta natural (n=9) e final da gestação de animais clonados (n=8), clones machos (n=4) e clones fêmeas (n=4). As proteínas foram localizadas por imuno-histoquímica indireta, exceto as subunidades de integrina α6, β1, αV e β3 que foram localizadas por imunofluorescência. A especificidade dos anticorpos e expressão protéica foi confirmada por Western blot e a expressão do RNAm foi avaliada por meio de RT-PCR e PCR em tempo real quantitativo. As células positivas para a laminina, TIMP-2, Ki-67 e lactogênio placentário (PL) foram quantificadas e para comparação entre os grupos. A proteína das subunidades α6 do receptor de integrina e β1 foi observada nos animais clonados e não clonados nos estromas materno e fetal e porção basal dos epitélios materno e fetal e foi co-localizada com a laminina. A proteína das subunidades αV e β3 do receptor de integrina foi observado nos estromas materno e fetal e foi co-localizado com a fibronectina. O TIMP-2 foi exclusivamente e especificamente localizado nas TGCs no início e final da gestação de animais clonados e não clonados, mas não houve diferença significativa em sua expressão. O PL apresentou a mesma localização do TIMP-2 em todos os grupos analisados. Houve diferença significativa (p<0,05) entre 270d e clones ao se comprar a expressão relativa do RNAm da subunidade de integrina β1 e do lactogênio placentário e ao se comparar a expressão protéica por western blot da laminina e do TIMP-2. Foi possível observar diferença significativa (p<0,05) entre o grupo controle e o grupo de animais clonados ao se quantificar o número de TGCs positivas para a laminina e para o lactogênio placentário. Apesar de algumas diferenças terem sido observadas na expressão de integrinas e de proteínas da ECM, sugere-se que a interação das integrinas com seus ligantes da ECM a termo não é um determinante da sobrevivência neonatal de bovinos clonados. Contudo, outros estudos são necessários para esclarecer se estas proteínas representam elementos chave na placentação de bovinos clonados em início de gestação. As diferenças observadas na expressão de integrinas e principalmente do PL entre clones fêmeas e machos sugerem possível influência de genes associados ao cromossomo sexual ou imprinting. / Integrins are transmembrane glycoproteins involved in cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) adhesion and signal transduction. They participate in the migration and fusion of trophoblast giant cells (TGC) with uterine epithelial cells in bovine placentomes, and interact with tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), considered important regulators of matrix metalloproteinases (MMPs). MMPs are rate-limiting enzymes degrading ECM proteins during tissue remodeling around embryo implantation, pregnancy and parturition. Since integrins are considered to be responsible for the maintenance of the architecture within tissues and MMPs may also regulate degradation and reconstitution of ECM required for trophoblast invasion, we aimed to verify a potential relation of integrins with common placental alterations observed in cloned animals (SCNT). To verify the placental functionality, expression of placental lactogen (PL) and Ki-67 antigen was also assessed. Bovine placentomes were collected and divided into 3 groups: 1) early and 2) late gestation derived from natural mating (n=9) and 3) late gestational bovine clones (n=8), also divided into male clones (n=4) and female clones (n=4). All proteins were localized by indirect immunohistochemistry except for integrin subunits α6, β1, αV and β3 that were shown by immunofluorescence. The antibody specificity and protein expression were confirmed by Western blot. Expression of mRNA was evaluated using RT-PCR and quantitative Real Time PCR. Positive cells for laminin, TIMP-2, Ki-67 and placental lactogen were quantified for comparisons among groups. The protein of integrin receptor subunits α6 and β1 was observed in both cloned and non-cloned animals in the fetal and maternal stroma and at the basal membrane of maternal and fetal epithelial cells, co-localized with laminin and with collagen IV. The integrin receptor subunits αV and β3 were observed in the fetal and maternal stroma, co-localized with fibronectin. TIMP-2 was specifically and exclusively localized in TGC in the early and term gestation in both cloned and non-cloned animals. PL has shown the same localization of TIMP-2 in all analyzed samples. Statistically significant differences (p<0,05) between term gestation of non-cloned and cloned animals were observed comparing the mRNA expression of integrin β1 subunit and placental lactogen and the protein expression of laminin and TIMP-2. There were also statistically significant differences (p<0,05) between non-cloned and cloned animals in the number of laminin and placental lactogen positive cells. Despite some differences in integrin and ECM proteins expression, our results suggest that the interaction between integrins and their ECM ligands in term gestation is not a determinant for the survival rate of newborn cloned calves. However further studies are necessary to elucidate if integrins represent key elements in the early placentation of SCNT bovines. The differences found in the integrin and principally in the placental lactogen expression between female and male cloned calves suggests the influence of sex-chromosome associated genes or imprinting.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02122009-091433 |
| Date | 04 September 2009 |
| Creators | Möller, Laura Artoni |
| Contributors | Papa, Paula de Carvalho |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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