Integrinas são glicoproteínas transmembrânicas envolvidas na adesão célula-célula e célula-proteina da matriz extracellular (ECM) que participam da migração e fusão de células trofoblásticas gigantes (TGC) com células do epitélio materno no placentoma bovino e interagem com inibidores teciduais de metalloproteinases (TIMPs), considerados importantes reguladores das metaloproteinases de matriz (MMPs), que são reconhecidas como passo limitande para ação de enzimas que atuam no remodelamento da ECM na implantação e na gestação. Uma vez que as integrinas são consideradas responsáveis pela manutenção da arquitetura tecidual e que as MMPs podem regular a degradação e a reconstituição da ECM necessária para a invasão do trofoblasto, temos como objetivo verificar uma possível relação das integrinas com alterações placentárias comumente observadas em gestações de animais clonados (SCNT). Para avaliar a funcionalidade placentária, a expressão do lactogênio placentário (PL) e do antígeno Ki-67 foram também verificadas. Placentomas bovinos foram coletados e divididos em 3 grupos: 1) início (n = 6) e 2) final (n = 3) da gestação de animais derivados de monta natural (n=9) e final da gestação de animais clonados (n=8), clones machos (n=4) e clones fêmeas (n=4). As proteínas foram localizadas por imuno-histoquímica indireta, exceto as subunidades de integrina &alpha;6, &beta;1, &alpha;V e &beta;3 que foram localizadas por imunofluorescência. A especificidade dos anticorpos e expressão protéica foi confirmada por Western blot e a expressão do RNAm foi avaliada por meio de RT-PCR e PCR em tempo real quantitativo. As células positivas para a laminina, TIMP-2, Ki-67 e lactogênio placentário (PL) foram quantificadas e para comparação entre os grupos. A proteína das subunidades &alpha;6 do receptor de integrina e &beta;1 foi observada nos animais clonados e não clonados nos estromas materno e fetal e porção basal dos epitélios materno e fetal e foi co-localizada com a laminina. A proteína das subunidades &alpha;V e &beta;3 do receptor de integrina foi observado nos estromas materno e fetal e foi co-localizado com a fibronectina. O TIMP-2 foi exclusivamente e especificamente localizado nas TGCs no início e final da gestação de animais clonados e não clonados, mas não houve diferença significativa em sua expressão. O PL apresentou a mesma localização do TIMP-2 em todos os grupos analisados. Houve diferença significativa (p<0,05) entre 270d e clones ao se comprar a expressão relativa do RNAm da subunidade de integrina &beta;1 e do lactogênio placentário e ao se comparar a expressão protéica por western blot da laminina e do TIMP-2. Foi possível observar diferença significativa (p<0,05) entre o grupo controle e o grupo de animais clonados ao se quantificar o número de TGCs positivas para a laminina e para o lactogênio placentário. Apesar de algumas diferenças terem sido observadas na expressão de integrinas e de proteínas da ECM, sugere-se que a interação das integrinas com seus ligantes da ECM a termo não é um determinante da sobrevivência neonatal de bovinos clonados. Contudo, outros estudos são necessários para esclarecer se estas proteínas representam elementos chave na placentação de bovinos clonados em início de gestação. As diferenças observadas na expressão de integrinas e principalmente do PL entre clones fêmeas e machos sugerem possível influência de genes associados ao cromossomo sexual ou imprinting. / Integrins are transmembrane glycoproteins involved in cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) adhesion and signal transduction. They participate in the migration and fusion of trophoblast giant cells (TGC) with uterine epithelial cells in bovine placentomes, and interact with tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), considered important regulators of matrix metalloproteinases (MMPs). MMPs are rate-limiting enzymes degrading ECM proteins during tissue remodeling around embryo implantation, pregnancy and parturition. Since integrins are considered to be responsible for the maintenance of the architecture within tissues and MMPs may also regulate degradation and reconstitution of ECM required for trophoblast invasion, we aimed to verify a potential relation of integrins with common placental alterations observed in cloned animals (SCNT). To verify the placental functionality, expression of placental lactogen (PL) and Ki-67 antigen was also assessed. Bovine placentomes were collected and divided into 3 groups: 1) early and 2) late gestation derived from natural mating (n=9) and 3) late gestational bovine clones (n=8), also divided into male clones (n=4) and female clones (n=4). All proteins were localized by indirect immunohistochemistry except for integrin subunits &alpha;6, &beta;1, &alpha;V and &beta;3 that were shown by immunofluorescence. The antibody specificity and protein expression were confirmed by Western blot. Expression of mRNA was evaluated using RT-PCR and quantitative Real Time PCR. Positive cells for laminin, TIMP-2, Ki-67 and placental lactogen were quantified for comparisons among groups. The protein of integrin receptor subunits &alpha;6 and &beta;1 was observed in both cloned and non-cloned animals in the fetal and maternal stroma and at the basal membrane of maternal and fetal epithelial cells, co-localized with laminin and with collagen IV. The integrin receptor subunits &alpha;V and &beta;3 were observed in the fetal and maternal stroma, co-localized with fibronectin. TIMP-2 was specifically and exclusively localized in TGC in the early and term gestation in both cloned and non-cloned animals. PL has shown the same localization of TIMP-2 in all analyzed samples. Statistically significant differences (p<0,05) between term gestation of non-cloned and cloned animals were observed comparing the mRNA expression of integrin &beta;1 subunit and placental lactogen and the protein expression of laminin and TIMP-2. There were also statistically significant differences (p<0,05) between non-cloned and cloned animals in the number of laminin and placental lactogen positive cells. Despite some differences in integrin and ECM proteins expression, our results suggest that the interaction between integrins and their ECM ligands in term gestation is not a determinant for the survival rate of newborn cloned calves. However further studies are necessary to elucidate if integrins represent key elements in the early placentation of SCNT bovines. The differences found in the integrin and principally in the placental lactogen expression between female and male cloned calves suggests the influence of sex-chromosome associated genes or imprinting.

Integrinas são glicoproteínas transmembrânicas envolvidas na adesão célula-célula e célula-proteina da matriz extracellular (ECM) que participam da migração e fusão de células trofoblásticas gigantes (TGC) com células do epitélio materno no placentoma bovino e interagem com inibidores teciduais de metalloproteinases (TIMPs), considerados importantes reguladores das metaloproteinases de matriz (MMPs), que são reconhecidas como passo limitande para ação de enzimas que atuam no remodelamento da ECM na implantação e na gestação. Uma vez que as integrinas são consideradas responsáveis pela manutenção da arquitetura tecidual e que as MMPs podem regular a degradação e a reconstituição da ECM necessária para a invasão do trofoblasto, temos como objetivo verificar uma possível relação das integrinas com alterações placentárias comumente observadas em gestações de animais clonados (SCNT). Para avaliar a funcionalidade placentária, a expressão do lactogênio placentário (PL) e do antígeno Ki-67 foram também verificadas. Placentomas bovinos foram coletados e divididos em 3 grupos: 1) início (n = 6) e 2) final (n = 3) da gestação de animais derivados de monta natural (n=9) e final da gestação de animais clonados (n=8), clones machos (n=4) e clones fêmeas (n=4). As proteínas foram localizadas por imuno-histoquímica indireta, exceto as subunidades de integrina &alpha;6, &beta;1, &alpha;V e &beta;3 que foram localizadas por imunofluorescência. A especificidade dos anticorpos e expressão protéica foi confirmada por Western blot e a expressão do RNAm foi avaliada por meio de RT-PCR e PCR em tempo real quantitativo. As células positivas para a laminina, TIMP-2, Ki-67 e lactogênio placentário (PL) foram quantificadas e para comparação entre os grupos. A proteína das subunidades &alpha;6 do receptor de integrina e &beta;1 foi observada nos animais clonados e não clonados nos estromas materno e fetal e porção basal dos epitélios materno e fetal e foi co-localizada com a laminina. A proteína das subunidades &alpha;V e &beta;3 do receptor de integrina foi observado nos estromas materno e fetal e foi co-localizado com a fibronectina. O TIMP-2 foi exclusivamente e especificamente localizado nas TGCs no início e final da gestação de animais clonados e não clonados, mas não houve diferença significativa em sua expressão. O PL apresentou a mesma localização do TIMP-2 em todos os grupos analisados. Houve diferença significativa (p<0,05) entre 270d e clones ao se comprar a expressão relativa do RNAm da subunidade de integrina &beta;1 e do lactogênio placentário e ao se comparar a expressão protéica por western blot da laminina e do TIMP-2. Foi possível observar diferença significativa (p<0,05) entre o grupo controle e o grupo de animais clonados ao se quantificar o número de TGCs positivas para a laminina e para o lactogênio placentário. Apesar de algumas diferenças terem sido observadas na expressão de integrinas e de proteínas da ECM, sugere-se que a interação das integrinas com seus ligantes da ECM a termo não é um determinante da sobrevivência neonatal de bovinos clonados. Contudo, outros estudos são necessários para esclarecer se estas proteínas representam elementos chave na placentação de bovinos clonados em início de gestação. As diferenças observadas na expressão de integrinas e principalmente do PL entre clones fêmeas e machos sugerem possível influência de genes associados ao cromossomo sexual ou imprinting. / Integrins are transmembrane glycoproteins involved in cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) adhesion and signal transduction. They participate in the migration and fusion of trophoblast giant cells (TGC) with uterine epithelial cells in bovine placentomes, and interact with tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), considered important regulators of matrix metalloproteinases (MMPs). MMPs are rate-limiting enzymes degrading ECM proteins during tissue remodeling around embryo implantation, pregnancy and parturition. Since integrins are considered to be responsible for the maintenance of the architecture within tissues and MMPs may also regulate degradation and reconstitution of ECM required for trophoblast invasion, we aimed to verify a potential relation of integrins with common placental alterations observed in cloned animals (SCNT). To verify the placental functionality, expression of placental lactogen (PL) and Ki-67 antigen was also assessed. Bovine placentomes were collected and divided into 3 groups: 1) early and 2) late gestation derived from natural mating (n=9) and 3) late gestational bovine clones (n=8), also divided into male clones (n=4) and female clones (n=4). All proteins were localized by indirect immunohistochemistry except for integrin subunits &alpha;6, &beta;1, &alpha;V and &beta;3 that were shown by immunofluorescence. The antibody specificity and protein expression were confirmed by Western blot. Expression of mRNA was evaluated using RT-PCR and quantitative Real Time PCR. Positive cells for laminin, TIMP-2, Ki-67 and placental lactogen were quantified for comparisons among groups. The protein of integrin receptor subunits &alpha;6 and &beta;1 was observed in both cloned and non-cloned animals in the fetal and maternal stroma and at the basal membrane of maternal and fetal epithelial cells, co-localized with laminin and with collagen IV. The integrin receptor subunits &alpha;V and &beta;3 were observed in the fetal and maternal stroma, co-localized with fibronectin. TIMP-2 was specifically and exclusively localized in TGC in the early and term gestation in both cloned and non-cloned animals. PL has shown the same localization of TIMP-2 in all analyzed samples. Statistically significant differences (p<0,05) between term gestation of non-cloned and cloned animals were observed comparing the mRNA expression of integrin &beta;1 subunit and placental lactogen and the protein expression of laminin and TIMP-2. There were also statistically significant differences (p<0,05) between non-cloned and cloned animals in the number of laminin and placental lactogen positive cells. Despite some differences in integrin and ECM proteins expression, our results suggest that the interaction between integrins and their ECM ligands in term gestation is not a determinant for the survival rate of newborn cloned calves. However further studies are necessary to elucidate if integrins represent key elements in the early placentation of SCNT bovines. The differences found in the integrin and principally in the placental lactogen expression between female and male cloned calves suggests the influence of sex-chromosome associated genes or imprinting.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Somatic cell nuclear transfer (SCNT) has been used in recent years for various purposes; to produce copies of genetically superior animals or genetically modified animals. Mainly as a research tool, trying to understand aspects related to cell reprogramming. Despite past several years since birth first animal cloned from a somatic cell, the efficiency remains low. The causes are multifactorial and may involve species particularities, the cell used as nuclear donor or enucleated cytoplasts. Currently it is known that the main problem found in cloned embryos is related to an incomplete cellular reprogramming, which in turn compromises the expression of genes required for normal embryonic development. In the present work we studied different cell cycle associations between cytoplasts (oocytes) and donor cells and its relation with a histone deacetylase inhibitor on the reprogramming of pig embryos produced by SCNT. Oocytes were enucleated at MII or TII (pre-activated) and the associated with previously synchronized cells in G1/G0 and G2/M phase of the cell cycle using or not a histone deacetylase inhibitor Scriptaid in the first hours of embryo culture. The results showed cell cycle incompatibilities between TII cytoplasts and G1/G0 cells even as MII cytoplasts G2/M cells regarding cell reprogramming. Scriptaid treatment showed a cell cycle dependent effect, since the improvement in embryo development was observed when using MII cytoplasts, regardless of the cell used as the donor nucleus. Although widely used in order to improve cell reprogramming in cloned embryos, it was demonstrated the relationship between inhibition of deacetylation with cell cycle interactions between and cytoplasts donor cells on the development of pig embryos produced by SCNT. / A clonagem por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) têm sido utilizada nos últimos anos para diversos fins, tanto para a produção de cópias de animais geneticamente superiores quanto para a produção de animais geneticamente modificados. Principalmente como ferramenta de pesquisa básica, buscando compreender aspectos relacionados a reprogramação celular. Apesar de passados vários anos desde o nascimento do primeiro animal clonado a partir de uma célula somática, a eficiência da técnica ainda permanece baixa. As causas são multifatoriais, podem envolver características da especie com que se está trabalhando bem como o tipo de célula utilizada como doadora de núcleo e citoplasto utilizado com receptor. Atualmente sabe-se que um dos principais problemas encontrados em embriões provenientes de clonagem estão relacionados a uma incompleta reprogramação da célula utilizada como doadora de núcleo, o que acaba por comprometer a expressão de genes necessários ao desenvolvimento embrionário normal. No presente trabalho foram estudadas diferentes associaçoes de ciclo celular entre citoplastos (oócitos) receptores e células doadoras de núcleo e sua relação com inibidores de deacetilase sobre a reprogramação de embriões suínos produzidos por SCNT. Oócitos foram enucleados no estágio de MII ou TII (pré-ativados) e associados a células previamente sincronizadas nas fases G1/G0 ou G2/M do ciclo celular, para cada grupo ainda foi utilizado ou não o tratamento com o inibidor de deacetilase Scriptaid nas primeiras horas de cultivo embrionário. O resultados obtidos permitem afirmar que existem incompatibilidades de ciclo celular entre citoplastos em TII e células em G1/G0 assim como entre citoplastos em MII e células em G2/M quanto à reprogramação celular. O tratamento com Scriptaid mostrou ter um efeito ciclo celular dependente, uma vez que só foi observada melhora no desenvolvimento embrionário quando utilizado com citoplastos em MII, independente da célula utilizada como doadora de núcleo. Apesar de amplamente utilizados com a finalidade de melhorar a reprogramação celular em embriões clonados, foi demostrado pela primeira vez a relação da inibição da desacetilação com diferentes interações de ciclo celular entre citoplastos e células doadoras de núcleo sobre o desenvolvimento de embriões produzidos por SCNT.

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a powerful tool for production of transgenic animals for various biomedical and agricultural applications. For instance, our group is using SCNT to produce transgenic goats to study the role of cardiac fibrosis in initiation and progression of atrial fibrillation. There is a possibility of cell transfer from a transgenic fetus to its non-transgenic surrogate mother, known as fetal microchimerism; from a transgenic mother to non-transgenic fetus, maternal microchimerism and from a transgenic twin to non-transgenic twin in utero. Initially, we have assessed the presence of fetal microchimerism in tissue samples from non-transgenic surrogates that delivered transgenic SCNT generated offspring. Then, the SCNT derived transgenic goats were naturally bred and non-transgenic offspring were used for the assessment of maternal microchimerism. Additionally, fetal-fetal microchimerism was evaluated using the tissue samples from non-transgenic twins of transgenic offspring. We investigated DNA from kidney, liver, lung, lymph node and spleen for the presence of neomycin resistant gene (Neo), which all transgenic SCNT generated females and their transgenic offspring tested positive for. We found no detectable maternal or fetal-fetal microchimerism, but fetal microchimerism was detected in lymph node of one of the surrogate dams that carried a SCNT pregnancy. The results of the study have direct implications on the use and disposal of non-transgenic surrogates and non-transgenic offspring.

A clonagem animal por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) é uma técnica de reprodução assistida que consiste em transferir o núcleo de uma célula de interesse a um oócito previamente enucleado. Sua utilização ainda apresenta eficiência baixa, com perdas embrionárias principalmente no início da gestação, ou em outras fases da gestação e no período perinatal devido à interação materno-fetal anormal com malformações diversas na placenta. Após o nascimento, a mortalidade está entre 12,5 e 42% devido às anormalidades neonatais já descritas como a síndrome do large offspring, com fetos exageradamente grandes, desenvolvimento anormal da placenta e crescimento não sincronizado de órgãos. Também são relatadas malformações musculoesqueléticas, aumento do diâmetro do cordão umbilical, dificuldades respiratórias e anormalidades metabólicas. Acredita-se que o mecanismo desta síndrome esteja relacionado com a reprogramação nuclear. Alinhando a gravidade das alterações e o custo elevado da técnica, torna-se necessário entender os mecanismos dessas alterações e desenvolver estratégias para prevenção e terapias para minimizar perdas. A avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos pode auxiliar no diagnóstico e acompanhamento terapêutico do neonato. O objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros clínicos, hematológicos, bioquímicos e de hemogasometria de bezerros clonados por SCNT, comparando os resultados com aqueles de bezerros gerados a partir de inseminação artificial. Dos bezerros clonados deste estudo, quatro vieram a óbito no período pós-natal. Alterações comuns nestes bezerros e que não ocorreram com os demais foram: pesos extremos ao nascimento, muito altos ou muito baixos; avaliação baixa no APGAR, principalmente após 5 minutos do nascimento; presença de líquido amniótico com viscosidade elevada; pH sanguíneo baixo imediatamente após o nascimento e elevação da creatinina sérica. As alterações nestes parâmetros em bezerros neonatos clonados podem indicar um risco de complicação no quadro geral dos clones, forçando medidas intensivas no tratamento para preservar a vida dos mesmos. Outras alterações frequentes nos clones, mas que não estavam necessariamente relacionadas a um quadro de risco foram: aumento do diâmetro dos vasos umbilicais; pH elevado ao nascimento e que evoluiu para acidose respiratória, acidose metabólica ou acidose mista respiratória e metabólica; elevação do volume celular médio; leucocitose por neutrofilia que foi observado em todos os clones devido à administração de corticoides ao nascimento; elevação gradual da contagem de plaquetas; diminuição da concentração de creatinina sérica e da atividade de AST. A gamaglutamiltransferase apresentou uma elevação mais discreta nos clones, podendo indicar uma falha na transferência de imunidade passiva. A concentração de lactado apresentou-se elevada em todos os clones em algum momento do período perinatal, indicando o quadro de acidose metabólica / Animal cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is an assisted reproductive technique in which the nucleus of a donor cell is transferred to a previously enucleated oocyte. Despite its potential benefits to research and agriculture, only 1% of the reconstructed oocytes develop into live healthy neonates. Embryo losses may occur early in pregnancy or in other stages of gestation, and during the perinatal period. These losses have been associated to abnormalities in maternal-fetal interaction, probably due to a deficient placental vascularization. Mortality rates after birth range between 12,5 to 42%, and the main abnormalities are related to the large offspring syndrome, with overly large cattle, abnormal placental development, and desynchronized organ development. Other problems reported include muscleskeletal disorders, enlarged umbilical cord, respiratory distress and metabolic disorders. The mechanism of this syndrome is probably related to nuclear reprogramming. Considering the severity of these abnormalities and the high costs of the technique, it is necessary to understand the mechanisms that lead to the pathology and develop strategies for preventing and treating the affected animals, minimizing financial losses. The evaluation of hematological and biochemical parameters is a very important tool for diagnosis and therapeutics. The aim of this study was to evaluate clinical, hematological and biochemical profiles, including blood gas analysis in calves originated by SCNT embryos, as well as comparing the same results from artificial insemination (AI) bred calves (control group). Amongst the cloned calves in this study, four died in the post-natal period. The most common abnormalities seen in these calves and that did not affect the others were: extreme birth weights (low or high), low APGAR score, especially when evaluated 5 minutes after birth, viscous amniotic fluid, low blood pH measured immediately after birth and high serum levels of creatinine. These abnormalities may present a risk of general health impairment in cloned calves, imposing better intensive care treatment in order to minimize death losses. Other frequent abnormalities in clones, but not necessarily related to risk of neonatal death immediately after birth are: enlarged umbilical vessels, high blood pH at birth that progresses to respiratory acidosis, metabolic acidosis or mixed respiratory metabolic acidosis, high mean cell volume, leukocytosis with neutrophilia due to glucocorticoids therapy after birth was observed in all of our clones, gradual increase in platelet count, low creatinine levels and low aspartate aminotransferase levels. There was a slight increase in gamma glutamyltransferase in clones compared to controls, which represent a poor passive immunity transfer. Lactate levels were high in all of the cloned animals at some point of the perinatal period, showing that they suffer from some degree of metabolic acidosis

A clonagem animal por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) é uma técnica de reprodução assistida que consiste em transferir o núcleo de uma célula de interesse a um oócito previamente enucleado. Sua utilização ainda apresenta eficiência baixa, com perdas embrionárias principalmente no início da gestação, ou em outras fases da gestação e no período perinatal devido à interação materno-fetal anormal com malformações diversas na placenta. Após o nascimento, a mortalidade está entre 12,5 e 42% devido às anormalidades neonatais já descritas como a síndrome do large offspring, com fetos exageradamente grandes, desenvolvimento anormal da placenta e crescimento não sincronizado de órgãos. Também são relatadas malformações musculoesqueléticas, aumento do diâmetro do cordão umbilical, dificuldades respiratórias e anormalidades metabólicas. Acredita-se que o mecanismo desta síndrome esteja relacionado com a reprogramação nuclear. Alinhando a gravidade das alterações e o custo elevado da técnica, torna-se necessário entender os mecanismos dessas alterações e desenvolver estratégias para prevenção e terapias para minimizar perdas. A avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos pode auxiliar no diagnóstico e acompanhamento terapêutico do neonato. O objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros clínicos, hematológicos, bioquímicos e de hemogasometria de bezerros clonados por SCNT, comparando os resultados com aqueles de bezerros gerados a partir de inseminação artificial. Dos bezerros clonados deste estudo, quatro vieram a óbito no período pós-natal. Alterações comuns nestes bezerros e que não ocorreram com os demais foram: pesos extremos ao nascimento, muito altos ou muito baixos; avaliação baixa no APGAR, principalmente após 5 minutos do nascimento; presença de líquido amniótico com viscosidade elevada; pH sanguíneo baixo imediatamente após o nascimento e elevação da creatinina sérica. As alterações nestes parâmetros em bezerros neonatos clonados podem indicar um risco de complicação no quadro geral dos clones, forçando medidas intensivas no tratamento para preservar a vida dos mesmos. Outras alterações frequentes nos clones, mas que não estavam necessariamente relacionadas a um quadro de risco foram: aumento do diâmetro dos vasos umbilicais; pH elevado ao nascimento e que evoluiu para acidose respiratória, acidose metabólica ou acidose mista respiratória e metabólica; elevação do volume celular médio; leucocitose por neutrofilia que foi observado em todos os clones devido à administração de corticoides ao nascimento; elevação gradual da contagem de plaquetas; diminuição da concentração de creatinina sérica e da atividade de AST. A gamaglutamiltransferase apresentou uma elevação mais discreta nos clones, podendo indicar uma falha na transferência de imunidade passiva. A concentração de lactado apresentou-se elevada em todos os clones em algum momento do período perinatal, indicando o quadro de acidose metabólica / Animal cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is an assisted reproductive technique in which the nucleus of a donor cell is transferred to a previously enucleated oocyte. Despite its potential benefits to research and agriculture, only 1% of the reconstructed oocytes develop into live healthy neonates. Embryo losses may occur early in pregnancy or in other stages of gestation, and during the perinatal period. These losses have been associated to abnormalities in maternal-fetal interaction, probably due to a deficient placental vascularization. Mortality rates after birth range between 12,5 to 42%, and the main abnormalities are related to the large offspring syndrome, with overly large cattle, abnormal placental development, and desynchronized organ development. Other problems reported include muscleskeletal disorders, enlarged umbilical cord, respiratory distress and metabolic disorders. The mechanism of this syndrome is probably related to nuclear reprogramming. Considering the severity of these abnormalities and the high costs of the technique, it is necessary to understand the mechanisms that lead to the pathology and develop strategies for preventing and treating the affected animals, minimizing financial losses. The evaluation of hematological and biochemical parameters is a very important tool for diagnosis and therapeutics. The aim of this study was to evaluate clinical, hematological and biochemical profiles, including blood gas analysis in calves originated by SCNT embryos, as well as comparing the same results from artificial insemination (AI) bred calves (control group). Amongst the cloned calves in this study, four died in the post-natal period. The most common abnormalities seen in these calves and that did not affect the others were: extreme birth weights (low or high), low APGAR score, especially when evaluated 5 minutes after birth, viscous amniotic fluid, low blood pH measured immediately after birth and high serum levels of creatinine. These abnormalities may present a risk of general health impairment in cloned calves, imposing better intensive care treatment in order to minimize death losses. Other frequent abnormalities in clones, but not necessarily related to risk of neonatal death immediately after birth are: enlarged umbilical vessels, high blood pH at birth that progresses to respiratory acidosis, metabolic acidosis or mixed respiratory metabolic acidosis, high mean cell volume, leukocytosis with neutrophilia due to glucocorticoids therapy after birth was observed in all of our clones, gradual increase in platelet count, low creatinine levels and low aspartate aminotransferase levels. There was a slight increase in gamma glutamyltransferase in clones compared to controls, which represent a poor passive immunity transfer. Lactate levels were high in all of the cloned animals at some point of the perinatal period, showing that they suffer from some degree of metabolic acidosis

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus. / During pregnancy, steroid hormones have essential roles in regulating key physiological events such as maternal recognition, endometrial receptivity, early embryonic development, and maintenance of pregnancy. However, very little is known about the production of these hormones nor about the principal factors and intracellular pathways implicated in the steroidogenic process in bovine placenta, during early and advanced pregnancy. In addition, placental abnormalities in cattle following an improper steroid production in bovine placenta have not been yet demonstrated. The aims of this thesis were to: 1) determine the occurrence and localization of the principal steroidogenic proteins in bovine placenta from day 50 to day 120 of pregnancy; 2) compare the placental expression of a series of steroidogenic genes and proteins between somatic cell nuclear transfer (SCNT) pregnancies and non-SCNT gestations; 3) investigate the impact of trophic hormone, and second messengers on steroidogenesis in bovine placenta at 140 +10 days of gestation. Using immunohistochemistry, western blot and qPCR techniques, we evaluated the presence of a wide range of steroidogenic genes (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SCARB1), that participate in the cholesterol transport and in the production of different types of steroids. In this thesis, we demonstrated the capability of the early bovine placenta to initiate steroidogenesis, and we also determined the principal cells implicated in this process. We found that maternal tissue expresses the principal steroidogenic markers suggesting it has a greater steroidogenic capacity compared to fetal tissue. Moreover, a complementary pattern of steroidogenic protein expression between the caruncle and the cotyledon were found, indicating that placental steroidogenesis requires cell to cell communication between the maternal and fetal cells. Having shown the principal cells involved in the synthesis of steroid hormones in bovine placenta during early pregnancies, we then studied possible alterations in steroidogenesis in cotyledonary tissue in SCNT at 40 days of pregnancy. We identified significant alterations in the expression of STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SULT1E1 transcripts. Therefore, we postulate that reduced expression of steroidogenic genes may cause an insufficient local biosynthesis of steroid hormones, which might contribute to the abnormal placental and fetal development in SCNT gestations at short or long term. Finally, we developed an efficient placentome explants culture model that allowed us to explore the specific mechanisms underlying placental steroidogenesis. We explored the stimulatory effect of trophic hormones and different second messengers on the expression of various steroidogenic proteins and the progesterone levels in placentome explants. By RIA and qPCR techniques, we found that although LH-like hormones (hCG), had a stimulatory effect on multiple steroidogenic genes, the calcium ionophore was the principal modulator in the synthesis of progesterone. These results suggest that in bovine placenta, the synthesis of progesterone is modulated principally by intracellular calcium influx, and cyclic nucleotides do not seem to be controlling this process. In conclusion, these studies significantly contribute to a better understanding of the driving mechanisms of placental steroid synthesis in early gestations and also provide new insights into the importance of placental steroids in the regulation of placental and fetal development.

A clonagem por transferência de núcleo de células somáticas (SCNT) em bovinos é uma biotécnica ineficiente, porém é uma ferramenta muito importante para pesquisas em biologia do desenvolvimento. Estudos prévios em nosso laboratório identificaram três fenótipos gestacionais de clones bovinos produzidos por SCNT: (1) gestação normal (CNG) - presença do embrião (EP), vesícula embrionária (VE) e corpo lúteo ativo (CL); (2) gestação anembrionada (CAG) - presença da VE e CL ativo e ausência de EP; (3) receptoras com CL ativo persistente sem a presença de EP e VE (CPCL). Vacas doadoras de embriões foram sincronizadas pelo protocolo de super-ovulação (SOV) e inseminadas artificialmente, os embriões obtidos após sete dias da ovulação foram transferidos para receptoras que ao ficarem gestantes formaram o grupo controle (GC). O objetivou do estudo foi investigar as características morfovasculares do útero nestes quatro fenótipos gestacionais. A hipótese central foi que as características morfovasculares do útero são moduladas diferentemente nos três fenótipos gestacionais de embriões clonados por SCNT e gestação controle. Vacas Nelores foram sincronizadas e utilizadas como receptoras de embriões. Coletas de sangue para análise de progesterona e exames ultrassonográficos nos modos B e Doppler para análise da morfologia e vascularização uterina foram realizados a cada dois dias a partir do dia 6 até o dia 30 pós-ovulação. Entre os dias 31 e 36, as receptoras foram abatidas e o útero coletado para análises in situ. A simetria entre cornos, o grau de desenvolvimento de carúnculas e da VE foram mensurados e amostras endometriais coletadas para quantificação relativa do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seu receptor do tipo 2 (VEGF-R2) por western-blotting. No total foram realizadas 212 sincronizações do ciclo estral, das quais 79 receptoras receberam embriões de clones por SCNT e 49 receberam embriões produzidos in vivo. Aos 25 dias pós-ovulação as taxas de concepção por grupo foram: CNG = 15,1% (12/79), CAG = 2,5% (2/79), CPCL = 8,8% (7/79) e CG = 24,4% (10/49). Duas receptoras da raça Tabapuã (Bos taurus indicus) do fenótipo do grupo CAG provindas de outro experimento foram incluídas nas análises. Algumas receptoras foram excluídas do experimento devido a perdas gestacionais ocorridas antes do momento do abate, restando para as análises sete receptoras no grupo CNG, três no CAG, quatro no CPCL e nove no CG. Somente o grupo CG apresentou diferença de perfusão vascular entre os cornos uterinos ipso e contralateral (P&LT;0,05). Em relação ao corno ipsolateral, os grupos CG e CNG apresentaram maior perfusão vascular em relação ao grupo CPCL do dia 24 ao 30 (P&LT;0,05). Porém, com a média dos escores da perfusão vascular endometrial de ambos os cornos, o grupo CNG apresentou maiores valores em relação aos grupos CAG e CPCL nos dias 24 e 30. Os índices de resistência vascular (RI) nas artérias uterinas confirmaram os dados subjetivos de diferença de perfusão vascular entre cornos, o corno ipsolateral do grupo CG apresentou menor RI em relação ao contralateral nos dias 22, 24, 28 e 30 (P&LT;0,05) e os grupos CNG e CPCL não apresentaram diferença entre cornos (P&GT;0,05). Entre os grupos, o RI no CG e CAG foi menor que no CPCL no dia 30 (P&LT;0,05). A concentração de progesterona (P4) sanguínea foi menor no grupo CPCL em relação aos grupos CG e CNG nos dias 18 e 26 (P&LT;0,05). A P4 atingiu valores próximos de 8 ng/ml a partir do dia 22 nos grupos CG e CNG, sendo que no grupo CPCL os valores foram inferiores à 6 ng/ml a partir do dia 14. As análises in situ revelaram maior frequência de assimetria de cornos uterinos no grupo CG em relação aos grupos CNG, CAG e CPCL; o grupo CNG obteve maior frequência de ocorrência de carúnculas e VE desenvolvidas nos dois cornos uterinos em relação aos grupos CAG e CPCL (P&LT;0,05), não diferindo do grupo CG (P&GT;0,05). O comprimento dos embriões do grupo CNG foi maior que dos embriões do grupo CG (P&LT;0,05), entre os dias 28 e 34. Não foi detectada diferença de abundância relativa das proteínas VEGF e VEGF-R2 entre os quatro grupos estudados, porém quando os grupos de gestações normais (CG e CNG) foram comparados com os grupos de gestações alteradas (CAG e CPCL) foi detectada maior abundância relativa para o fragmento de 75 kDa da proteína do VEGF-R2 no grupo de gestações alteradas. A hipótese central do estudo, que afirma que as alterações morfovasculares do útero gestante durante o primeiro mês são moduladas em diferentes graus de forma dependente à qualidade de desenvolvimento do concepto foi confirmada. Por fim, este estudo proporcionou um melhor entendimento da fisiologia endócrina, morfológica e vascular das gestações normais e alteradas de embriões clonados por SCNT durante o primeiro mês gestacional, fornecendo base para novos estudos sobre o desenvolvimento e manutenção da gestação inicial em bovinos. / Cloning by nuclear transfer of somatic cells (SCNT) in cattle is an inefficient biotechnique. However, it is a very important tool for research in developmental biology. Previous studies from our lab have identified three gestational phenotypes of bovine clones: (1) Clone normal gestation (CNG) - presence of embryo (EP = embryo proper), embryonic vesicle (EV) and corpus luteum (CL); (2) Clone anembryonic gestation (CAG) - presence of EV and CL and no EP; (3) Recipient presenting only a persistent CL (CPCL). Embryo donor cows were synchronized by superovulation protocol (SOV) and artificially inseminated, embryos obtained after seven days of ovulation were transferred to the control group (CG). This study aimed to investigate whether modulation of the morphological and vascular abnormalities of the uterus by the presence of the cloned conceptus is different between the three gestational clone phenotypes and control. The central hypothesis was that the morphovascular characteristics of the uterus are modulated differently in the three gestational phenotypes of embryos cloned by SCNT and control gestation. Nellore cows were synchronized and used as embryo recipients. Blood collections for progesterone analysis and ultrasound examinations in B and Doppler modes for analysis of uterine morphology and vascularization were performed every two days from day 6 to day 30. Between 31-36 days, the recipients were slaughtered and the uteri were collected for in situ analyzes. The symmetry between horns, the degree of caruncle and EV development were measured and endometrial samples were collected for relative quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor type 2 (VEGF-R2) by western blotting. A total of 212 estrous cycle synchronizations were performed, 79 recipients cows received clone embryos by SCNT and 49 embryos produced in vivo. At 25 days after ovulation the conception rates by group were: CNG = 15.1% (12/79), CAG = 2.5% (2/79), CPCL = 8.8% (7/79), and CG = 24.4% (10/49). Two pregnant cows Tabapuã (Bos taurus indicus) of CAG phenotype from another experiment were included in the analyzes. Some recipients were excluded from the experiment due to gestational losses occurring before the time of slaughter, remaining seven recipients in CNG group, three in CAG, four in CPCL and nine in CG. Only the CG group had a difference in vascular perfusion between the ipso and contralateral uterine horns (P&LT;0.05). In relation to the ipsilateral horn, the CG and CNG groups presented higher vascular perfusion compared to the CPCL group from day 24 to 30 (P&LT;0.05). However, with the average of endometrial vascular perfusion scores of both uterine horns, the CNG group presented higher values in compared to the CAG and CPCL groups on days 24 and 30. The vascular resistance index (RI) of the uterine arteries confirmed the subjective data of vascular perfusion between horns. The ipsilateral horn of the CG group presented lower RI in compared to the contralateral on days 22, 24, 28 and 30 (P&LT;0, 05) and the CNG and CPCL groups did not show this difference between horns (P&GT;0.05). Among groups, the RI in CG and CAG was lower than in the CPCL on day 30 (P&LT;0.05). The blood progesterone (P4) concentration was lower in the CPCL group than in the CG and CNG groups on days 18 and 26 (P&LT;0.05). P4 reached values close to 8 ng/ml after day 22 in the CG and CNG groups, and in the CPCL group the values were lower than 6 ng/ml after day 14. In situ analyzes revealed a higher frequency of uterine horn asymmetry in the CG group compared to the CNG, CAG and CPCL groups; the CNG group had a higher frequency of caruncles and EV development in the two uterine horns compared to the CAG and CPCL groups (P&LT;0.05), not differing from the CG group (P&GT;0.05). The length of the embryos of the CNG group was higher than that of the embryos of the CG group (P&LT;0.05) between days 28 to 34. No difference was detected in the relative abundance of VEGF and VEGF-R2 proteins among the four groups, but when the normal gestation groups (CG and CNG) were compared with the altered pregnancies groups (CAG and CPCL) a greater relative abundance was detected for the 75 kDa fragment of the VEGF-R2 protein in the group of altered pregnancies. The central hypothesis of the study, which states that the morphovascular changes of the pregnant uterus during the first month are modulated in different degrees depending on the quality of development of the concept was confirmed. Finally, this study provided a better understanding of the endocrine, morphological and vascular physiology of normal and altered embryos of cloning by SCNT during the first gestational month, providing a basis for new studies on the development and maintenance of initial gestation in cattle.

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus. / During pregnancy, steroid hormones have essential roles in regulating key physiological events such as maternal recognition, endometrial receptivity, early embryonic development, and maintenance of pregnancy. However, very little is known about the production of these hormones nor about the principal factors and intracellular pathways implicated in the steroidogenic process in bovine placenta, during early and advanced pregnancy. In addition, placental abnormalities in cattle following an improper steroid production in bovine placenta have not been yet demonstrated. The aims of this thesis were to: 1) determine the occurrence and localization of the principal steroidogenic proteins in bovine placenta from day 50 to day 120 of pregnancy; 2) compare the placental expression of a series of steroidogenic genes and proteins between somatic cell nuclear transfer (SCNT) pregnancies and non-SCNT gestations; 3) investigate the impact of trophic hormone, and second messengers on steroidogenesis in bovine placenta at 140 +10 days of gestation. Using immunohistochemistry, western blot and qPCR techniques, we evaluated the presence of a wide range of steroidogenic genes (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SCARB1), that participate in the cholesterol transport and in the production of different types of steroids. In this thesis, we demonstrated the capability of the early bovine placenta to initiate steroidogenesis, and we also determined the principal cells implicated in this process. We found that maternal tissue expresses the principal steroidogenic markers suggesting it has a greater steroidogenic capacity compared to fetal tissue. Moreover, a complementary pattern of steroidogenic protein expression between the caruncle and the cotyledon were found, indicating that placental steroidogenesis requires cell to cell communication between the maternal and fetal cells. Having shown the principal cells involved in the synthesis of steroid hormones in bovine placenta during early pregnancies, we then studied possible alterations in steroidogenesis in cotyledonary tissue in SCNT at 40 days of pregnancy. We identified significant alterations in the expression of STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SULT1E1 transcripts. Therefore, we postulate that reduced expression of steroidogenic genes may cause an insufficient local biosynthesis of steroid hormones, which might contribute to the abnormal placental and fetal development in SCNT gestations at short or long term. Finally, we developed an efficient placentome explants culture model that allowed us to explore the specific mechanisms underlying placental steroidogenesis. We explored the stimulatory effect of trophic hormones and different second messengers on the expression of various steroidogenic proteins and the progesterone levels in placentome explants. By RIA and qPCR techniques, we found that although LH-like hormones (hCG), had a stimulatory effect on multiple steroidogenic genes, the calcium ionophore was the principal modulator in the synthesis of progesterone. These results suggest that in bovine placenta, the synthesis of progesterone is modulated principally by intracellular calcium influx, and cyclic nucleotides do not seem to be controlling this process. In conclusion, these studies significantly contribute to a better understanding of the driving mechanisms of placental steroid synthesis in early gestations and also provide new insights into the importance of placental steroids in the regulation of placental and fetal development.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA09MA118.pdf: 160083 bytes, checksum: 25c9450a31e59d2364610c952a970219 (MD5) Previous issue date: 2009-09-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In somatic cell nuclear transfer (SCNT), the type of the recipient cytoplast plays a key role on nuclear reprogramming. Distinct cytoplasts and karyoplasts and different activation protocols were used for bovine embryo cloning aiming to evaluate the effect of the type of cytoplast (oocyte and/or zygote) and the activation protocol (chemical, AQ, or spermatic, AE) on development of cloned blastocysts produced by handmade cloning (HMC). After 17 h of in vitro maturation (MIV), 2,946 oocytes were enucleated by manual bisection resulting in either MII cytoplasts (enucleated) or MII karyoplasts (non-enucleated). An additional group of 2,368 oocytes, in vitro-fertilized (FIV) for 6 h, were manually bisected and segregated in either FIV cytoplasts (enucleated) or FIV karyoplasts (non-enucleated). Cells from a primary culture previously established from a skin biopsy from an adult female bovine were used as nuclei donors (karyoplast CS). Structures were allocated to (a) control groups: FIV; parthenogenesis using zona-intact (PG c/) or zona-free oocytes (PG s/); and clones by SCNT; or (b) experimental groups: G1, FIV cytoplast + MII cytoplast + CS karyoplast; G2, MII cytoplast + FIV karyoplast; G3, FIV cytoplast + FIV karyoplast; G4, FIV cytoplast + FIV cytoplast + CS karyoplast; and G5, MII cytoplast + MII karyoplast. Following electrofusion, experimental groups G1 to G5 were allocated to sub-groups of either sperm-mediated (AE) or additional chemical (AQ) activation. The in vitro culture was carried out in the WOW (wellof- the-well) system. After 20 replications, cleavage (D2) and blastocyst (D7) rates were compared by the &#967;2 test, with values for total cell number and cell allocation in the blastocyst, determined by differential staining, being evaluated by ANOVA, with pairwise comparisons by the Tukey test, for P<0.05 (P<0.05). The only experimental group that yielded a blastocyst development similar to the FIV (27.0%) and SCNT (31.4%) control groups was the subgroup G1 AE (28.2%). This fact may be attributed to a more proper synchrony between the karyoplast and cytoplasts and/or to a more suitable activation process. Embryo development in subgroups G1 AQ (13.7%), G4 AQ (6.4%) and G4 AE (8.7%) was lower than in G1 AE, possibly due to a higher degree of asynchrony in the activation process or cell cycle. The lack of development in groups G2 and G3, irrespective of the activation protocol, was possibly due to the manipulation process during a highly sensible biological period. Likewise, the low cleavage (57.0%) and the lack of development in group G5 (spontaneous activation) in fact showed that the manipulation induced weak spontaneous oocyte activation. In general, total cell number and cell allocation were similar between groups with development to the blastocyst stage. In conclusion, the activation process appeared to be as important to embryo development as the type of cytoplast or karyoplast used for embryo reconstruction. The production of cloned bovine embryos using a more physiological activation process (AE) was proven as a viable procedure, with efficiency rates observed in subgroup G1 AE being similar to groups FIV or TNCS / Na clonagem por transferência nuclear com célula somática (TNCS), o tipo de citoplasto receptor desempenha papel chave na reprogramação nuclear. Distintos citoplastos e carioplastos e condições de ativação foram utilizadas na reconstrução de embriões bovinos com o objetivo de avaliar o efeito do tipo de citoplasto (oócito e/ou zigoto) e do método de ativação (química, AQ, ou espermática, AE) no desenvolvimento de blastocistos clonados produzidos pela técnica de clonagem manual (Handmade Cloning, HMC). Após 17 h de maturação in vitro (MIV), 2.946 oócitos foram enucleados por bissecção manual, resultando em hemi-oócitos enucleados (citoplastos MII) e não enucleados (carioplastos MII). Outros 2.368 oócitos submetidos a 6 h de fecundação in vitro (FIV) foram bisseccionados manualmente e segregados em hemi-zigotos enucleados (citoplastos FIV) e não enucleados (carioplastos FIV). Células de um cultivo celular estabelecido a partir da biópsia auricular de uma fêmea bovina adulta foram utilizadas como núcleos doadores (carioplasto CS). As estruturas foram dispostas em (a) grupos controle: FIV; partenogênese com oócitos com (PG c/) ou sem zona pelúcida (PG s/); e clone por TNCS; ou (b) grupos experimentais: G1, citoplasto FIV + citoplasto MII + carioplasto CS; G2, citoplasto MII + carioplasto FIV; G3, citoplasto FIV + carioplasto FIV; G4, citoplasto FIV + citoplasto FIV + carioplasto CS; e G5, citoplasto MII + carioplasto MII. Após a eletrofusão das estruturas, os grupos experimentais G1 a G45 foram divididos em subgrupos de AQ ou AE. O cultivo in vitro foi realizado pelo sistema WOW (well-of-the-well). Após 20 repetições, as taxas de clivagem (D2) e blastocisto (D7) foram comparadas pelos testes de &#967;2 e os valores para o número total de células e a alocação das linhagens celulares nos blastocistos, determinados por coloração diferencial, foram avaliados por análise de variância, com pareamento comparativo pelo teste de Tukey, para P<0,05. O único grupo experimental que apresentou desenvolvimento embrionário no D7 semelhante aos controles FIV (27,0%) e TNCS (31,4%) foi o subgrupo G1 AE (28,2%). Isso pode ser atribuído a uma melhor sincronia do ciclo celular entre citoplastos e/ou carioplasto e um mais adequado processo de ativação. O desenvolvimento embrionário nos grupos G1 AQ (13,7%), G4 AQ (6,4%) e G4 AE (8,7%) foi menor do que o G1 AE, possivelmente devido à assincronia do processo de ativação ou ciclo celular. O desenvolvimento embrionário nulo dos grupos G2 e G3, independente da ativação, possivelmente foi decorrente da manipulação das estruturas em um momento biologicamente sensível. Da mesma forma, a baixa clivagem (57,0%) e o desenvolvimento nulo no grupo G5 de ativação espontânea demonstraram de fato que a manipulação estimulou o processo de ativação embrionária de forma sub-limiar. Em geral, não houve diferença no número de células e alocação celular nos grupos onde houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Conclui-se que o processo de ativação foi tão significativo para o desenvolvimento embrionário que o tipo de citoplasto e carioplasto usados na reconstrução embrionária. A produção de embriões clones com um método mais fisiológico de ativaçao (AE) mostrou-se como um procedimento viável, obtendo-se no grupo G1 AE a mesma eficiência observada na FIV ou na TNCS