Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV08MA028.pdf: 640511 bytes, checksum: 7739954e4535ca25f1e1be5d8d3266a8 (MD5) Previous issue date: 2008-05-26 / Animal cloning has been associated with developmental abnormalities, with the level of heteroplasmy caused by the procedure per se being one of the potential determining factors for the appearance of the problems. Embryo aggregation may be an alternative to minimize such effects during cloning. The aim of this study was to determine the effect of the heteroplasmy caused by fusion of hemi-cytoplasts or by aggregation of hemi-embryos, varying the final cytoplasmic volume, on development and cell density of embryos produced by handmade cloning (HMC), parthenogenesis or in vitro fertilization (IVF). In vitro-matured bovine oocytes, selected by the presence of a polar body, were manually bisected, followed by fluorescence screening of hemi-cytoplasts. One or two enucleated hemi-cytoplasts were paired and fused with one skin somatic cell. Activated clone and zona-free parthenote embryos and hemi-embryos were in vitro-cultured in microwells (WOW system), being allocated to one of six experimental groups, based on the volume of cytoplasm used for embryo reconstruction either by fusion of hemi-cytoplasts or by aggregation of hemi-embryos or embryo, on a per WOW basis, as follows: single clone or parthenote hemi-embryos (G1: 1 x 50%); aggregation of two (G2: 2 x 50%), three (G3: 3 x 50%) or four (G4: 4 x 50%) clone or parthenote hemi-embryos; single clone or parthenote embryos (G5: 1 x 100%); or aggregation of two clone or parthenote embryos (G6: 2 x 100%). Zona-intact parthenote or IVF embryos (G7: Zona-intact, 100%), used as controls, were in vitro-cultured in 4-well dishes. Data were analyzed by &#967;2, ANOVA, Pearson s correlation or linear regression, for P<0.05. In general, results indicated that the increase in the number of aggregated structures within each WOW was followed by a linear increase in cleavage, blastocyst rate and cell density. Even though those observations were more pronounced in parthenotes, cell density and embryo quality were superior in clone embryos. The increase in cytoplasmic volume, either by fusion or by aggregation, had a positive effect on embryo development, supporting the establishment of pregnancies after transfer to female recipients. Nevertheless, the use of only half of the normal volume did not affect the developmental potential to the blastocyst stage, but reduced cell number. In conclusion, despite the increase in embryo development and cell density per WOW, embryo aggregation did not improve blastocyst yield or cell number, on a hemi-cytoplast basis / A clonagem animal tem sido associada a anormalidades de desenvolvimento, com o nível de heteroplasmia causados pela técnica per se sendo um dos potenciais fatores determinantes do aparecimento dos problemas. A agregação embrionária pode ser uma alternativa para minimizar tais efeitos causados pela clonagem. O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da heteroplasmia pela fusão de hemi-citoplastos ou da agregação de hemi-embriões, variando-se o volume citoplasmático final, no desenvolvimento e na densidade celular de embriões produzidos por handmade cloning (HMC), partenogênese ou fecundação in vitro (FIV). Oócitos bovinos maturados in vitro, selecionados pela presença do corpúsculo polar, foram bisseccionados manualmente, seguidos da seleção de hemi-citoplastos por fluorescência. Um ou dois hemi-citoplastos enucleados foram pareados e fusionados a uma célula somática cutânea. Embriões e hemi-embriões de clonagem e de partenogênese (sem zona pelúcida) foram ativados e cultivados in vitro em micropoços (sistema WOW), sendo alocados para um de seis grupos experimentais, baseado no volume de citoplasma utilizado para a reconstrução embrionária pela fusão de hemi-citoplastos ou agregação de hemi-embriões e embriões, por micropoço (WOW), conforme a seguir: um único hemi-embrião de clonagem ou de partenogênese (G1: 1 x 50%); agregação de dois (G2: 2 x 50%), três (G3: 3 x 50%) ou quatro (G4: 4 x 50%) hemi-embriões de clonagem ou de partenogênese; um único embrião de clonagem ou de partenogênese (G5: 1 x 100%); ou agregação de dois embriões de clonagem ou de partenogênese (G6: 2 x 100%). Embriões intactos oriundos de FIV ou de partenogênese (G7: Zona intacta, 100%), utilizados como controle, foram cultivados in vitro em placas de 4 poços. Os resultados foram analisados pelos testes do &#967;2, ANOVA, correlação de Pearson ou regressão linear, para P<0.05. Em termos gerais, os resultados indicaram que o aumento no número de estruturas agregadas em cada micropoço foi seguido por um aumento linear nas taxas de clivagem, de blastocisto e na densidade celular. Mesmo que tais observações tenham sido mais pronunciadas nos partenotos, a densidade celular e a qualidade embrionária foram superiores em embriões clonados. O aumento no volume citoplasmático por fusão ou agregação apresentou um efeito positivo no desenvolvimento embrionário, dando suporte ao estabelecimento de prenhezes após a transferência para fêmeas receptoras. No entanto, a utilização de apenas metade do volume normal não afetou o potencial de desenvolvimento até o estádio de blastocisto, mas reduziu o número de células. Em conclusão, apesar de haver um aumento no desenvolvimento e densidade celular em embriões por micropoço, a agregação embrionária não melhorou a taxa de blastocistos ou o número de células, com base no número de hemi-citoplastos utilizados por embrião

Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.

Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.

Sistemas de produção in vitro de embriões mamíferos muitas vezes requerem que o cultivo embrionário seja realizado de forma individualizada. Entretanto, os resultados obtidos com o cultivo in vitro (CIV) individual são inconstantes e, por vezes, inferiores ao CIV em grupo. Entre os sistemas que requerem o CIV individual, a técnica de handmade cloning (HMC) se destaca por produzir embriões sem zona pelúcida que não podem ser cultivados agrupados em protocolos convencionais de CIV. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo de embriões bovinos clonados pela técnica de HMC e submetidos a três diferentes sistemas de CIV em micropoços (Well of the well – WOW), sendo um industrial, confeccionado em polidimetilsiloxano (PDMS), que visou à padronização da configuração do sistema de CIV. Após 11 replicações, de 3.876 complexos cumuli-oócito bovinos maturados in vitro, 3.437 (88,6%) oócitos apresentaram a extrusão do 1º corpúsculo polar. Após a digestão da zona pelúcida, 2.992 estruturas foram bisseccionadas manualmente, com a produção de 2.288 hemi-citoplastos. Reconstruiram-se 1.011 embriões pela adesão de dois hemi-citoplastos a uma célula somática (célula-tronco mesenquimal bovina de uma fêmea adulta da raça Nelore), dos quais 751 (74,2%) embriões fusionaram após eletrofusão, sendo 715 ativados quimicamente. Os embriões clonados (n=705) foram então alocados aleatoriamente em três grupos experimentais para o CIV: Grupo 1 (G1) – micropoço modificado (WOW-modificado, FELTRIN et al., 2006a); Grupo 2 (G2) – micropoço convencional (WOW-convencional , VATJA et al., 2000); e Grupo 3 (G3) – micropoço – PDMS (WOW-PDMS) . Como grupo controle (FIV, Grupo 4, G4), 594 oócitos foram colocados em maturação, fecundação e cultivo in vitro, em paralelo aos grupos clonados. Os resultados das taxas de clivagem no Dia 2, de blastocisto no Dia 7 e de prenhez no Dia 30 de desenvolvimento foram analisados pelo teste do χ2 com nível de significância de 5%. Não houve diferença significativa quanto à taxa de clivagem nos diferentes grupos. Entretanto, a taxa de blastocisto (BL) no G1 (99/239; 41,4%) foi significativamente superior à observada no G2 (72/232; 31,0%) e no G3 (68/234; 29,1%), sendo estas últimas semelhantes entre si. A taxa de BL do grupo controle (315/594; 53,0%) foi superior aos três grupos experimentais. Finalmente, o desenvolvimento in vivo até o Dia 30 de prenhez não diferiu entre os grupos G1 (7/15; 46,7%), G2 (7/13; 53,9%) e G3 (6/16; 50,0%). O sistema em micropoço modificado promoveu melhores condições de CIV a embriões clonados por HMC, traduzido por maiores taxas de BL, não se refletindo, entretanto, em diferenças no desenvolvimento in vivo subseqüente à transferência para fêmeas receptoras. / In vitro production systems for mammalian embryos quite often require embryos to be cultured individually. However, results obtained after individual embryo in vitro culture (IVC) are frequently inconsistent and inferior to IVC in groups. The Handmade Cloning (HMC) procedure is among the systems that require individual IVC, since zona-free embryos cannot be grouped for culture by standard IVC protocols. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo development of bovine embryos cloned by HMC, after the IVC in three distinct microwell arrangements, including an industrial chip, manufactured in polydimethylsiloxane (PDMS), which aimed to standardize the pattern of the IVC system. After 11 replications, 3,437 (88.6%) oocytes were selected based on the extrusion of the first polar body, out of 3,876 in vitro-matured bovine cumuli-oocyte complexes. Following zona pellucida digestion, 2,992 structures were manually bisected, generating 2,288 hemi-cytoplasts. A total of 1,011 embryos were reconstructed by the adhesion of two hemi-cytoplasts to a somatic cell (bovine mesenchymal stem cells from an adult Nelore female), with 751 fusing (74.2%) following electrofusion, and 715 being chemically activated. Cloned embryos (n=705) were then randomly allocated to one of three IVC experimental groups: Group 1 (G1) – modified microwells (FELTRIN et al., 2006a); Group 2 (G2) – conventional microwells (VATJA et al., 2000); and Group 3 (G3) – microwells in PDMS. As control group (IVF, Group 4, G4), 594 oocytes were in vitro-matured, fertilized and cultured in parallel to the cloned groups. Cleavage, blastocyst and pregnancy rates evaluated on Days 2, 7 and 30 of development were analyzed by the χ2 test, for a significance level of 5%. No differences in cleavage rates were observed between groups. However, blastocyst rates in G1 (99/239; 41.4%) were significantly higher than in G2 (72/232; 31.0%) and in G3 (68/234; 29.1%), which did not differ between one another. Blastocyst rates in the IVF control group (315/594; 53.0%) were in turn higher than in all cloned experimental groups. Finally, in vivo development to Day 30 of pregnancy was not different between G1 (7/15; 46.7%), G2 (7/13; 53.9%) and G3 (6/16; 50.0%). In summary, the modified microwell system promoted superior development to the blastocyst stage than both the conventional and the DMPS-based microwell systems, with no impact on the subsequent in vivo development after transfer to female recipients.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA09MA118.pdf: 160083 bytes, checksum: 25c9450a31e59d2364610c952a970219 (MD5) Previous issue date: 2009-09-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In somatic cell nuclear transfer (SCNT), the type of the recipient cytoplast plays a key role on nuclear reprogramming. Distinct cytoplasts and karyoplasts and different activation protocols were used for bovine embryo cloning aiming to evaluate the effect of the type of cytoplast (oocyte and/or zygote) and the activation protocol (chemical, AQ, or spermatic, AE) on development of cloned blastocysts produced by handmade cloning (HMC). After 17 h of in vitro maturation (MIV), 2,946 oocytes were enucleated by manual bisection resulting in either MII cytoplasts (enucleated) or MII karyoplasts (non-enucleated). An additional group of 2,368 oocytes, in vitro-fertilized (FIV) for 6 h, were manually bisected and segregated in either FIV cytoplasts (enucleated) or FIV karyoplasts (non-enucleated). Cells from a primary culture previously established from a skin biopsy from an adult female bovine were used as nuclei donors (karyoplast CS). Structures were allocated to (a) control groups: FIV; parthenogenesis using zona-intact (PG c/) or zona-free oocytes (PG s/); and clones by SCNT; or (b) experimental groups: G1, FIV cytoplast + MII cytoplast + CS karyoplast; G2, MII cytoplast + FIV karyoplast; G3, FIV cytoplast + FIV karyoplast; G4, FIV cytoplast + FIV cytoplast + CS karyoplast; and G5, MII cytoplast + MII karyoplast. Following electrofusion, experimental groups G1 to G5 were allocated to sub-groups of either sperm-mediated (AE) or additional chemical (AQ) activation. The in vitro culture was carried out in the WOW (wellof- the-well) system. After 20 replications, cleavage (D2) and blastocyst (D7) rates were compared by the &#967;2 test, with values for total cell number and cell allocation in the blastocyst, determined by differential staining, being evaluated by ANOVA, with pairwise comparisons by the Tukey test, for P<0.05 (P<0.05). The only experimental group that yielded a blastocyst development similar to the FIV (27.0%) and SCNT (31.4%) control groups was the subgroup G1 AE (28.2%). This fact may be attributed to a more proper synchrony between the karyoplast and cytoplasts and/or to a more suitable activation process. Embryo development in subgroups G1 AQ (13.7%), G4 AQ (6.4%) and G4 AE (8.7%) was lower than in G1 AE, possibly due to a higher degree of asynchrony in the activation process or cell cycle. The lack of development in groups G2 and G3, irrespective of the activation protocol, was possibly due to the manipulation process during a highly sensible biological period. Likewise, the low cleavage (57.0%) and the lack of development in group G5 (spontaneous activation) in fact showed that the manipulation induced weak spontaneous oocyte activation. In general, total cell number and cell allocation were similar between groups with development to the blastocyst stage. In conclusion, the activation process appeared to be as important to embryo development as the type of cytoplast or karyoplast used for embryo reconstruction. The production of cloned bovine embryos using a more physiological activation process (AE) was proven as a viable procedure, with efficiency rates observed in subgroup G1 AE being similar to groups FIV or TNCS / Na clonagem por transferência nuclear com célula somática (TNCS), o tipo de citoplasto receptor desempenha papel chave na reprogramação nuclear. Distintos citoplastos e carioplastos e condições de ativação foram utilizadas na reconstrução de embriões bovinos com o objetivo de avaliar o efeito do tipo de citoplasto (oócito e/ou zigoto) e do método de ativação (química, AQ, ou espermática, AE) no desenvolvimento de blastocistos clonados produzidos pela técnica de clonagem manual (Handmade Cloning, HMC). Após 17 h de maturação in vitro (MIV), 2.946 oócitos foram enucleados por bissecção manual, resultando em hemi-oócitos enucleados (citoplastos MII) e não enucleados (carioplastos MII). Outros 2.368 oócitos submetidos a 6 h de fecundação in vitro (FIV) foram bisseccionados manualmente e segregados em hemi-zigotos enucleados (citoplastos FIV) e não enucleados (carioplastos FIV). Células de um cultivo celular estabelecido a partir da biópsia auricular de uma fêmea bovina adulta foram utilizadas como núcleos doadores (carioplasto CS). As estruturas foram dispostas em (a) grupos controle: FIV; partenogênese com oócitos com (PG c/) ou sem zona pelúcida (PG s/); e clone por TNCS; ou (b) grupos experimentais: G1, citoplasto FIV + citoplasto MII + carioplasto CS; G2, citoplasto MII + carioplasto FIV; G3, citoplasto FIV + carioplasto FIV; G4, citoplasto FIV + citoplasto FIV + carioplasto CS; e G5, citoplasto MII + carioplasto MII. Após a eletrofusão das estruturas, os grupos experimentais G1 a G45 foram divididos em subgrupos de AQ ou AE. O cultivo in vitro foi realizado pelo sistema WOW (well-of-the-well). Após 20 repetições, as taxas de clivagem (D2) e blastocisto (D7) foram comparadas pelos testes de &#967;2 e os valores para o número total de células e a alocação das linhagens celulares nos blastocistos, determinados por coloração diferencial, foram avaliados por análise de variância, com pareamento comparativo pelo teste de Tukey, para P<0,05. O único grupo experimental que apresentou desenvolvimento embrionário no D7 semelhante aos controles FIV (27,0%) e TNCS (31,4%) foi o subgrupo G1 AE (28,2%). Isso pode ser atribuído a uma melhor sincronia do ciclo celular entre citoplastos e/ou carioplasto e um mais adequado processo de ativação. O desenvolvimento embrionário nos grupos G1 AQ (13,7%), G4 AQ (6,4%) e G4 AE (8,7%) foi menor do que o G1 AE, possivelmente devido à assincronia do processo de ativação ou ciclo celular. O desenvolvimento embrionário nulo dos grupos G2 e G3, independente da ativação, possivelmente foi decorrente da manipulação das estruturas em um momento biologicamente sensível. Da mesma forma, a baixa clivagem (57,0%) e o desenvolvimento nulo no grupo G5 de ativação espontânea demonstraram de fato que a manipulação estimulou o processo de ativação embrionária de forma sub-limiar. Em geral, não houve diferença no número de células e alocação celular nos grupos onde houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Conclui-se que o processo de ativação foi tão significativo para o desenvolvimento embrionário que o tipo de citoplasto e carioplasto usados na reconstrução embrionária. A produção de embriões clones com um método mais fisiológico de ativaçao (AE) mostrou-se como um procedimento viável, obtendo-se no grupo G1 AE a mesma eficiência observada na FIV ou na TNCS