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Previous issue date: 2006-08-31 / The temperature-dependent dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is
the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), a human systemic mycosis highly
prevalent in countries of Latin America. P. brasiliensis is subjected to different insults from
human host, such as oxidative stress caused by reactive oxygen species produced by the host
during the infection. Thioredoxin (TRX) is an intracellular redox protein that is required to
maintain redox homeostasis in response to both reductive and oxidative stress conditions in
several organisms. We report here the characterization of a 811 bp cDNA Pbtrx1, encoding a
PbTRX1 of 116 amino acids, with a predicted molecular mass of 12 kDa and pI 5.2. This
putative protein presented one highly conserved active site motif (WCGPC) between TRXs
from several organisms. The phylogenetic analysis performed with PbTRX1 and TRXs from
other organisms, putted P. brasiliensis in the fungi clade. We also performed the prediction of
the secondary structure of PbTRX1 that shows a pattern characteristic of the open twisted
alpha/beta, similar to TRX secondary structures described in other fungus. In order to obtain
the recombinant PbTRX1, the expression construct pGEX-4T-3-trx1 was introduced into
Escherichia coli cells and the expression and purification of the recombinant protein was
obtained. The recPbTRX1 and PbTRX1 from yeast cells extract were found to catalyze the
reduction of insulin. However the PbTRX1 from yeast cells extract treated with H2O2 showed
highly insulin reduction activity than the yeast cells no treated. PbTRX1 was detected by
Western blotting in the extracts from yeast cells growth and from mycelium to yeast
transition. The yeast cells growth was significantly inhibited by H2O2; however the mycelium
to yeast transition was little affected by this oxidant. Semi-quantitative RT-PCR was
employed to analysis the expression of Pbtrx1 gene in response to H2O2. The level of Pbtrx1
transcripts was higher in yeast cells treated with H2O2 than in yeast cells no treated. To realize
how P. brasiliensis deals with oxidative stress is essential to understand the mechanisms
involved in its survival in the host. It may be possible that PbTRX1 enhances survival of P.
brasiliensis in the host, protecting the fungus against the reactive oxygen species and
allowing, in this way, the progress of the infection. / O fungo termodimórfico, Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico
da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na
América Latina. No hospedeiro humano, o fungo P. brasiliensis está sujeito a vários insultos,
tais como o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas de oxigênio, que são
produzidas pelas células de defesa do hospedeiro durante a infecção. A tiorredoxina (TRX) é
proteina redox intracelular que participa da manutenção da homeostase redox da célula, tanto
em condições de estresse oxidativo quanto redutor. Neste trabalho apresentamos a
caracterização de um cDNA de 811 pb, designado como Pbtrx1, que codifica para uma
proteína, PbTRX1, de 116 resíduos de aminoácidos com massa molecular predita de 12 kDa e
pI de 5,2. PbTRX1 apresentou um motivo de sítio ativo conservado (WCGPC) entre as TRXs
de vários organismos. Análise filogenética com PbTRX1 e TRXs de outros organismos
colocou P. brasiliensis no clado de fungos. Foi também realizada a predição da estrutura
secundária da PbTRX1, que apresentou um padrão característico formado por cadeias-β que
estão envolvidas por α-hélices. Para obter a proteína recombinante, recPbTRX1, foi realizada
a construção do pGEX-4T-3-trx1 e este foi introduzido nas células de Escherichia coli.
Assim, a expressão e purificação da proteína recombinante foi obtida. A proteína recPbTRX1
e a PbTRX1, presente no extrato protéico de células leveduriformes, apresentaram atividade
redutora de insulina. Entretanto, a PbTRX1 presente no extrato protéico de células
leveduriformes tratadas com H2O2, mostrou maior atividade redutora de insulina quando
comparada com extrato de células leveduriformes não tratadas. A PbTRX1 foi detectada, por
Western blotting, em extratos de células leveduriformes em crescimento e durante a transição
de micélio para levedura. O crescimento das células leveduriformes foi inibido por H2O2,
entretanto a transição de micélio para levedura foi pouco afetada por este oxidante. A técnica
de RT-PCR semi-quantitativo foi empregada para análise da expressão do Pbtrx1 em resposta
ao H2O2. O nível de transcritos de Pbtrx1 foi maior nas células leveduriformes tratadas com
H2O2 do que nas células não tratadas. Para compreender como P. brasiliensis lida com
estresse oxidativo é essencial entender os mecanismos envolvidos em sua sobrevivência no
hospedeiro. É possível que PbTRX1 aumente a sobrevivência de P. brasiliensis no
hospedeiro, protegendo o fungo contra espécies reativas de oxigênio e, desta maneira,
permitindo o progresso da infecção.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tde/1275 |
| Date | 31 August 2006 |
| Creators | DOMINGOS, Fernanda de Castro |
| Contributors | JESUÍNO, Rosália Santos Amorim |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Mestrado em Biologia, UFG, BR, Ciências Biolóicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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