Os escorpiões estão entre os animais peçonhentos mais antigos da Terra, existindo por mais de 400 milhões de anos. As peçonhas desses animais contêm uma mistura complexa de proteínas e peptídeos capazes de interagir com alta complexidade no organismo de suas vítimas. No Brasil, o principal gênero de escorpião responsável pelos acidentes é o gênero Tityus, no qual estão inseridas as espécies T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus e T. stigmurus. A peçonha do T. serrulatus é composta em sua maioria de peptídeos com ação em canais para sódio e potássio, mas possuem também enzimas como hialuronidases, proteases e outros compostos como hipotensinas, peptídeos antimicrobianos (PAMs) e peptídeos potenciadores de bradicinina. Muitos dos componentes encontrados nas peçonhas de escorpiões têm sido estudados por possuírem importantes atividades farmacológicas, como propriedades analgésicas, antimicrobianas, antitumorais e anti-inflamatórias. Todavia, sabe-se que há uma grande dificuldade na obtenção dessas substâncias em consequência do baixo rendimento dos componentes isolados a partir da peçonha. Com isso, atualmente, tem sido utilizada a expressão heteróloga de proteínas para viabilizar a obtenção de toxinas em quantidades suficientes para uso biotecnológico. Diante desse panorama, o presente trabalho teve como objetivo a expressão de dois peptídeos presentes na peçonha de Tityus serrulatus, bem como sua comparação com os peptídeos nativos com relação à sua estrutura e atividade funcional. As toxinas escolhidas foram a Ts8 e a Ts8-propeptídeo, também chamada de scorpine-like, que atuam em canais para potássio (KTxs). As sequências e os cDNAs moldes das toxinas expressas foram obtidos da biblioteca de cDNA da glândula de Tityus serrulatus construída em nosso laboratório. Os genes sintéticos contendo as toxinas de interesse foram transformados em células de Pichia pastoris da linhagem KM71H. A expressão das Ts8 e Ts8-propeptídeo recombinantes revelou a presença das toxinas, porém as mesmas sofreram degradação proteolítica por enzimas da P. pastoris. Dessa forma, foram realizadas as avaliações das expressões na presença de substrato como os casaminoácidos, bem como na diminuição do pH, temperatura e adição de inibidores de protease. Além disso, foi possível obter a rTs8, embora clivada, com atividade sobre canais para potássio. Novas etapas de purificação em colunas de troca iônica e fase reversa foram padronizadas para a obtenção das toxinas nativas a partir da peçonha de T. serrulatus. Adicionalmente, foi possível identificar a presença da Ts8 e Ts8-propeptídeo (scorpine-like) nativas por espectrometria de massas em uma das frações obtidas da cromatografia da peçonha. A adição de casaminoácidos foi favorável para a expressão das toxinas, porém não foi suficiente para minimizar a degradação proteolítica. Ensaios funcionais com os fragmentos das toxinas recombinantes e com as toxinas nativas demonstraram a liberação de citocinas como TNF-? e IL1-? em algumas das toxinas testadas. Além disso, as toxinas demonstraram inibir o crescimento da Pichia pastoris em teste antifúngico e não foram tóxicas para células de macrófagos alveolares nas concentrações testadas. Assim, esse trabalho contribuiu para demonstrar a atividade de enzimas proteolíticas na expressão em P.pastoris, avaliar as condições em que são liberadas, bem como demonstrar a atividade da rTs8 em ensaio eletrofisiológico e a atividade antifúngica das toxinas recombinantes e nativas. / Scorpions are among the oldest venomous animals on Earth, existing for over 400 million years. The venoms of these animals contain a complex mixture of proteins and peptides that can interact with high complexity with their victims. In Brazil, the main genus of scorpions responsible for accidents is Tityus genus, in which the species T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus and T. stigmurus are inserted. T. serrulatus venom (Tsv) is composed mostly of peptides with action on sodium and potassium channels, but also have enzymes such as hyaluronidases, proteases and other compounds such as hypotensins, antimicrobial peptides (AMPs) and bradykinin potentiating peptides. Many of the components found in scorpion venoms have been studied for their important pharmacological activities, such as analgesic, antimicrobial, antitumor and anti-inflammatory properties. However, it is known that there is great difficulty in obtaining these substances because of the low yield of the isolated components from the venom. With this, the heterologous expression of proteins has been used to enable the production of toxins in sufficient amount for biotechnological purpose. In this panorama, the aim of this study is the expression of two peptides present in the venom of Tityus serrulatus, as well as their comparison with the native peptides in relation to their structure and functional activity. The toxins chosen were Ts8 and Ts8-propeptide, also called scorpine-like, acting on potassium channels (KTxs). Sequences and cDNAs templates of the expressed toxins were obtained from the cDNA library of the Tityus serrulatus gland constructed in our laboratory. Synthetic genes containing the toxins of interest were transformed into Pichia pastoris cells of strain KM71H. Expression of the recombinant Ts8 and Ts8-propeptide revealed the presence of the toxins, but they underwent proteolytic degradation by P. pastoris enzymes. Thus, we evaluate the expression in the presence of substrate as the casamino acids, as well as in the decrease of pH, temperature and addition of protease inhibitors. In addition, rTs8, although cleaved, could be obtained with potassium channel activity. New purification steps in ion exchange and reverse phase columns were standardized to obtain the native toxins from the venom of T. serrulatus. In addition, it was possible to identify the presence of native Ts8 and Ts8-propeptide (scorpine-like) by mass spectrometry in one of the fractions obtained from the venom chromatography. The addition of casamino acids was favourable for toxin expression, but was not sufficient to minimize proteolytic degradation. Functional assays with recombinant toxin fragments and native toxins have demonstrated the release of cytokines such as TNF-? and IL-1? in some of the toxins tested. In addition, the toxins were shown to inhibit the growth of Pichia pastoris in the antifungal test and were not toxic to alveolar macrophages cells at the concentrations tested. Thus, this work contributed to demonstrate the activity of proteolytic enzymes in P.pastoris expression, to evaluate the conditions under which they are released, as well as to demonstrate the activity of rTs8 in the electrophysiological assay and the antifungal activity of recombinant and native toxins
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31072017-110740 |
| Date | 02 June 2017 |
| Creators | Cordeiro, Francielle Almeida |
| Contributors | Braga, Eliane Candiani Arantes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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