A cada dia os relatos sobre acidentes por escorpiões vêm aumentando no Brasil, com frequentes casos fatais. Dentre os escorpiões que compõem a fauna brasileira temos o Tityus serrulatus, considerado o mais perigoso por conta de sua facilidade adaptativa em centros urbanos e das manifestações clínicas severas em vítimas acidentadas, como febre, agitação psicomotora, hipertensão arterial seguida de hipotensão e edema pulmonar agudo. Dentre os componentes da peçonha se destacam os peptídeos estruturados por ligações dissulfeto, que são abundantemente relatados na literatura e atuam em canais de Na+ e K+. Ao contrário, os peptídeos lineares são pouco caracterizados. A partir desta premissa, nosso grupo identificou peptídeos lineares do veneno através de um screening empregando a enzima elastase. Esta enzima foi escolhida por estar envolvida em processos inflamatórios exacerbados, como em casos de edema pulmonar agudo, que é um dos principais sintomas do escorpionismo. Encontramos mais de 700 sequências peptídicas onde, através de um criterioso processo com o uso de bancos de dados de sequências depositadas e a literatura, selecionamos nove moléculas inéditas (TsP1 a TsP9) e duas já estudadas (hipotensinas I e II) para a síntese. Dentre estas moléculas, identificamos possíveis criptídeos advindos da Ts19 e moléculas com processamento diferenciado envolvendo a combinação de sequências peptídicas diferentes (peptídeos quiméricos), primeiramente relatadas e investigadas na peçonha do T. serrulatus neste trabalho. Além da elastase, utilizamos as enzimas de importância médica tripsina, ECA e NEP e os peptídeos sintéticos em nossos estudos, visando aumentar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos no escorpionismo e, também, com base no potencial biotecnológico de moléculas capazes de exercerem modulações das atividades destas peptidases. Destacaram-se peptídeos que podem ter ação em processos inflamatórios, uma vez que foram capazes de aumentar a atividade da elastase e tripsina, com destaque para o TsP5, que também apresentou citotoxidade intermediária. Alguns peptídeos aumentaram a atividade da ECA, sendo o peptídeo TsP2 capaz de potencializar a ação da bradicinina in vivo. A hipotensina I foi caracterizada como um inibidor não competitivo da NEP (Ki = 4,35 µM), podendo indicar a possível inibição desta metalopeptidase nos casos de hipotensão, onde a hipotensina I pode agir de forma sinérgica com o [des-Arg1]-Proctolin (Ki = 0,94 µM para a NEP), outro peptídeo linear do veneno caracterizado por nosso grupo. Os peptídeos não foram reconhecidos pelos soros antiescorpiônico e antiaracnídico produzidos pelo Instituto Butantan podendo indicar limitações na imunoterapia utilizada no tratamento das vítimas. Por fim, além dos novos peptídeos identificados, finalizamos a caracterização do FTR, um tripeptídeo que apresentou em nossos trabalhos anteriores propriedades antinociceptivas. No presente trabalho, demonstramos que este peptídeo é capaz de agir na via opioide, atuando em receptores delta de forma direta. Assim, com a identificação e caracterização destas moléculas conseguimos novos dados referentes a possíveis origens e processamento, ações tóxicas no envenenamento e potencial biotecnológico de alguns peptídeos lineares do T. serrulatus. / Reports of scorpions accidents with humans are increasing in Brazil, with some of the cases resulting in death. Among the scorpions from the Brazilian fauna, Tityus serrulatus is considered the most dangerous species, due to its easy adaptation in urban centers, and because it brings severe clinical manifestations in the victims, such as fever, psychomotor agitation, arterial hypertension followed by hypotension and acute pulmonary edema. Among the venom components that stand out are the peptides structured by disulfide bonds, which are richly reported in the literature and act on Na+ and K+ channels. In contrast, linear peptides are poorly characterized. From this evidence, our group identified linear peptides of the venom using the serine protease elastase screening. This enzyme was chosen because it is involved in inflammatory processes, such as cases of acute pulmonary edema, one of the main symptoms of scorpionism caused by T. serrulatus. More than 700 peptide sequences where found and, through a careful process using protein databases and the literature, from these all, we selected nine novel (TsP1 to TsP9) and two already characterized (hypotensins I and II) sequences for synthesis. Among these molecules, we identified possible cryptides derived from Ts19 and others molecules, with different processing involving combination of different peptide sequences (chimeric peptides), which are here firstly reported and investigated in the venom of T. serrulatus. In addition to elastase, we tested other enzymes of medical importance - trypsin, ACE and NEP - with the synthetic peptides, aiming to increase the knowledge of molecular mechanisms involved in scorpionism and also based on the biotechnological potential of peptidase-modulator molecules. Peptides that may have an action in inflammatory processes were highlighted, since they were able to increase the activity of elastase and trypsin, especially the TsP5, which also showed intermediate cytotoxicity. Some peptides increased the ACE activity, with the peptide TsP2 capable of potentializing the action of bradykinin in vivo. Hypotensin I was characterized as a noncompetitive inhibitor of NEP (Ki = 4.35 µM) and may indicate the possible inhibition of this metallopeptidase in cases of hypotension, where hypotensin I may act synergistically with [des-Arg1] - Proctolin (Kµ = 0.94 µM for NEP), a linear peptide present in the venom already characterized by our group. The peptides were not recognized by the antiscorpion and antiarachinid sera produced by the Butantan Institute and may indicate limitations in the immunotherapy. Finally, in addition to the new identified peptides, we concluded the in vivo characterization of FTR, a tripeptide that presented antinociceptive properties in our previous studies. In the present work, we demonstrate that this peptide is able to act in the opioid pathway, acting directly on delta receptors. Thus, with the identification and characterization of these molecules we obtained new data regarding possible origins and processing, toxic actions in the envenomation and biotechnological potential of some linear peptides of T. serrulatus venom.

Os escorpiões estão entre os animais peçonhentos mais antigos da Terra, existindo por mais de 400 milhões de anos. As peçonhas desses animais contêm uma mistura complexa de proteínas e peptídeos capazes de interagir com alta complexidade no organismo de suas vítimas. No Brasil, o principal gênero de escorpião responsável pelos acidentes é o gênero Tityus, no qual estão inseridas as espécies T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus e T. stigmurus. A peçonha do T. serrulatus é composta em sua maioria de peptídeos com ação em canais para sódio e potássio, mas possuem também enzimas como hialuronidases, proteases e outros compostos como hipotensinas, peptídeos antimicrobianos (PAMs) e peptídeos potenciadores de bradicinina. Muitos dos componentes encontrados nas peçonhas de escorpiões têm sido estudados por possuírem importantes atividades farmacológicas, como propriedades analgésicas, antimicrobianas, antitumorais e anti-inflamatórias. Todavia, sabe-se que há uma grande dificuldade na obtenção dessas substâncias em consequência do baixo rendimento dos componentes isolados a partir da peçonha. Com isso, atualmente, tem sido utilizada a expressão heteróloga de proteínas para viabilizar a obtenção de toxinas em quantidades suficientes para uso biotecnológico. Diante desse panorama, o presente trabalho teve como objetivo a expressão de dois peptídeos presentes na peçonha de Tityus serrulatus, bem como sua comparação com os peptídeos nativos com relação à sua estrutura e atividade funcional. As toxinas escolhidas foram a Ts8 e a Ts8-propeptídeo, também chamada de scorpine-like, que atuam em canais para potássio (KTxs). As sequências e os cDNAs moldes das toxinas expressas foram obtidos da biblioteca de cDNA da glândula de Tityus serrulatus construída em nosso laboratório. Os genes sintéticos contendo as toxinas de interesse foram transformados em células de Pichia pastoris da linhagem KM71H. A expressão das Ts8 e Ts8-propeptídeo recombinantes revelou a presença das toxinas, porém as mesmas sofreram degradação proteolítica por enzimas da P. pastoris. Dessa forma, foram realizadas as avaliações das expressões na presença de substrato como os casaminoácidos, bem como na diminuição do pH, temperatura e adição de inibidores de protease. Além disso, foi possível obter a rTs8, embora clivada, com atividade sobre canais para potássio. Novas etapas de purificação em colunas de troca iônica e fase reversa foram padronizadas para a obtenção das toxinas nativas a partir da peçonha de T. serrulatus. Adicionalmente, foi possível identificar a presença da Ts8 e Ts8-propeptídeo (scorpine-like) nativas por espectrometria de massas em uma das frações obtidas da cromatografia da peçonha. A adição de casaminoácidos foi favorável para a expressão das toxinas, porém não foi suficiente para minimizar a degradação proteolítica. Ensaios funcionais com os fragmentos das toxinas recombinantes e com as toxinas nativas demonstraram a liberação de citocinas como TNF-? e IL1-? em algumas das toxinas testadas. Além disso, as toxinas demonstraram inibir o crescimento da Pichia pastoris em teste antifúngico e não foram tóxicas para células de macrófagos alveolares nas concentrações testadas. Assim, esse trabalho contribuiu para demonstrar a atividade de enzimas proteolíticas na expressão em P.pastoris, avaliar as condições em que são liberadas, bem como demonstrar a atividade da rTs8 em ensaio eletrofisiológico e a atividade antifúngica das toxinas recombinantes e nativas. / Scorpions are among the oldest venomous animals on Earth, existing for over 400 million years. The venoms of these animals contain a complex mixture of proteins and peptides that can interact with high complexity with their victims. In Brazil, the main genus of scorpions responsible for accidents is Tityus genus, in which the species T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus and T. stigmurus are inserted. T. serrulatus venom (Tsv) is composed mostly of peptides with action on sodium and potassium channels, but also have enzymes such as hyaluronidases, proteases and other compounds such as hypotensins, antimicrobial peptides (AMPs) and bradykinin potentiating peptides. Many of the components found in scorpion venoms have been studied for their important pharmacological activities, such as analgesic, antimicrobial, antitumor and anti-inflammatory properties. However, it is known that there is great difficulty in obtaining these substances because of the low yield of the isolated components from the venom. With this, the heterologous expression of proteins has been used to enable the production of toxins in sufficient amount for biotechnological purpose. In this panorama, the aim of this study is the expression of two peptides present in the venom of Tityus serrulatus, as well as their comparison with the native peptides in relation to their structure and functional activity. The toxins chosen were Ts8 and Ts8-propeptide, also called scorpine-like, acting on potassium channels (KTxs). Sequences and cDNAs templates of the expressed toxins were obtained from the cDNA library of the Tityus serrulatus gland constructed in our laboratory. Synthetic genes containing the toxins of interest were transformed into Pichia pastoris cells of strain KM71H. Expression of the recombinant Ts8 and Ts8-propeptide revealed the presence of the toxins, but they underwent proteolytic degradation by P. pastoris enzymes. Thus, we evaluate the expression in the presence of substrate as the casamino acids, as well as in the decrease of pH, temperature and addition of protease inhibitors. In addition, rTs8, although cleaved, could be obtained with potassium channel activity. New purification steps in ion exchange and reverse phase columns were standardized to obtain the native toxins from the venom of T. serrulatus. In addition, it was possible to identify the presence of native Ts8 and Ts8-propeptide (scorpine-like) by mass spectrometry in one of the fractions obtained from the venom chromatography. The addition of casamino acids was favourable for toxin expression, but was not sufficient to minimize proteolytic degradation. Functional assays with recombinant toxin fragments and native toxins have demonstrated the release of cytokines such as TNF-? and IL-1? in some of the toxins tested. In addition, the toxins were shown to inhibit the growth of Pichia pastoris in the antifungal test and were not toxic to alveolar macrophages cells at the concentrations tested. Thus, this work contributed to demonstrate the activity of proteolytic enzymes in P.pastoris expression, to evaluate the conditions under which they are released, as well as to demonstrate the activity of rTs8 in the electrophysiological assay and the antifungal activity of recombinant and native toxins

O escorpião amarelo Tityus serrulatus (Ts) é considerado a espécie mais perigosa do Brasil, e muitas das toxinas de sua peçonha já foram isoladas e caracterizadas. No entanto, as frações XIIA e XIIB, obtidas da cromatografia de troca iônica da peçonha de Ts, possuem várias toxinas de baixa massa molecular ainda não caracterizadas. Através da combinação de técnicas de RP-FPLC em colunas C8 e C18, espectrometria de massas e/ou sequenciamento amino-terminal, foi possível isolar e identificar os componentes destas frações, bem como realizar as caracterizações estrutural, por RMN, e eletrofisiológica, por Two Microelectrode Voltage Clamp, de algumas neurotoxinas isoladas. Foram escolhidas três toxinas de interesse: Ts11, Ts9 e Ts1-G. Nossos resultados mostram que a Ts11 foi capaz de bloquear canais para potássio dependentes de voltagem (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, e Shaker IR, bloqueando em 25%, 27%, 25%, 15%, 12%, e 10% as correntes de potássio, respectivamente. A Ts11 possui uma estrutura única (estrutura obtida por RMN): ICK scaffold sem os elementos de estrutura secundária (alfa-hélice ou fita-beta). Esta estrutura diferenciada, somada à atividade biológica caracterizada neste estudo, evidencia uma nova subfamília de KTxs, a qual foi denominada como ?-KTx, sendo a Ts11 o primeiro membro desta subfamília: ?-KTx1.1. A caracterização funcional da Ts9 mostra que a mesma não apresenta atividade bloqueadora sobre os canais Kv testados (Kv1.1; Kv1.2; Kv1.3; Kv1.4; Kv1.5; Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv7.2; Kv10.1 hERG e Shaker IR), na concentração de 100 nM. Apesar da Ts9 não ter bloqueado os canais testados, ela apresenta estrutura e resíduoschave que sugerem sua ação em Kvs e estudo anteriormente publicado mostra que ela é um potente ligante de canais para potássio ativados por cálcio de baixa condutância (SK). Também foi conduzido um estudo comparativo entre a Ts1e sua isoforma precursora Ts1-G nos canais para sódio dependentes de voltagem Nav1.1 - 1.8 e DmNav1, a fim de analisar a importância da amidação C-terminal. A Ts1 madura possui região C-terminal amidada, enquanto que sua isoforma Ts1-G não é amidada, pois apresenta uma Gly na região Cterminal (última etapa de transformação pós-traducional, anterior a ação da enzima ?- amidante). A Ts1-G não apresentou ação nos canais (Nav) na concentração testada (100 nM), enquanto que a Ts1 (100 nM) age como ?- toxina, reduzindo o limiar de excitação dos canais Nav e/ou reduzindo as correntes de sódio, evidenciando que a amidação C-terminal é importante para a atividade biológica da toxina madura. Adicionalmente, nas análises por MALDI/TOF das frações XIIA e XIIB, foram encontrados 45 componentes cujas massas moleculares não correspondem a de toxinas já isoladas, abrindo perspectivas para a identificação de moléculas com potencial uso biotecnológico, visto que toxinas com ação em canais iônicos podem ser ferramentas valiosas para a elucidação das características farmacológicas, fisiológicas e estruturais dos seus alvos. / The yellow scorpion Tityus serrulatus (Ts) is considered the most dangerous species of Brazil, and several toxins present in its venom have been already isolated and characterized. However, fractions XIIA and XIIB obtained from ion exchange chromatography of Ts crude venom, presented many low molecular weight toxins which have not been characterized yet. Through a combination of RP-FPLC technique using C8 and C18 columns, mass spectrometry and / or amino terminal sequencing, it was possible to isolate and identify the components of these fractions, as well as perform structural characterization thru NMR and electrophysiological characterization using Two Microelectrode Voltage Clamp, of some of the neurotoxins isolated. It was choosen three toxins of interest: Ts11, Ts9 and Ts1-G. Our results show that Ts11 was able to block voltage gated potassium channels (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, and Shaker IR, blocking 25%, 27%, 25% 15%, 12% and 10% of the potassium currents, respectively. Ts11 has an unique structure (structure obtained thru NRM technique): ICK scaffold without the elements of secondary structure (alpha helix or beta-sheet). Additionaly, the differentiated structure and functional characterization, Ts11 shows us an evidence of a new subfamily of toxins, which was named as ?-KTX, and therefore, Ts11 is the first member of this subfamily: ?-KTx1.1. The functional characterization of Ts9 shows that it has no blocking activity on the tested Kv channels (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1 , Kv4.2, Kv7.2, Kv10.1, hERG and Shaker IR) at a concentration of 100 nM. Despite the Ts9 have not blocked the tested channels, it presents structure and key-amino acid residues that suggest its action on Kvs and previously published study shows that it is a potent ligant for slow conductance calciumactivated potassium channels (SK). It was also conducted a comparative electrophysiological study between the Ts1and its precursor isoform Ts1-G on voltage gated sodium channels, in order to evaluate the importance of the C-terminal amidation. The mature Ts1 has amidated C-terminal region, whereas Ts1-G isoform is not amidated, and therefore has a Gly at the Cterminal region (last step of post-translational modification, before the action of the enzyme ?-amidante). The Ts1-G showed no action on Nav channels at the concentration tested (100 nM), whereas Ts1 (100 nM) acts as ?-toxin, lowering the excitation threshold of Nav channels and/or reducing sodium currents, evidencing that the C-terminal amidation is important for the biological activity of the mature toxin. Additionally, the analyses by MALDI/TOF of the fractions XIIA and XIIB showed several molecules whose molar masses do not match the toxins already identified, opening prospects for the identification of new molecules with potential biotechnological use, considering that toxins that act on ion channels can be valuable tools for the elucidation of pharmacological, physiological and structural characteristics of their targets.

Envenenamentos por animais peçonhentos são frequentes e quase 35% dos acidentes são ocasionados por escorpiões, especialmente por Tityus serrulatus. A peçonha do escorpião amarelo Tityus serrulatus tem despertado o interesse médico e científico por ser uma mistura complexa de mucopolissacarídeos, inibidores de proteases, histamina, neurotoxinas, entre outros componentes. As neurotoxinas são as principais responsáveis pelos sintomas do envenenamento, por possuírem alta afinidade e seletividade para canais iônicos sensíveis à voltagem. Além de induzirem a liberação de neurotransmissores, as neurotoxinas também são capazes de estimular a liberação de citocinas, principalmente nos casos de envenenamento de maior gravidade. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização de uma nova toxina, denominada Ts19 fragmento I (Ts19 frag I) presente nas frações VII e VIII obtidas por cromatografia da peçonha de Tityus serrulatus em CM-celulose-52. Entre os componentes preponderantes destas frações estão a Ts4, um peptídeo não tóxico que induz reações alérgicas, e a Ts3-KS, que interage com canais para sódio e foi capaz de induzir a liberação de IL-6. As frações VII e VIII foram aplicadas em coluna de fase reversa C18 (4,6 x 250 mm) e os picos 19, 22 (Ts19 frag I) e 23 foram recromatografados em coluna C18 (2,1 x 250 mm). O sequenciamento por degradação de Edman permitiu a determinação de 57 resíduos de aminoácidos da Ts19 frag I, incluindo 6 resíduos de cisteína. Esta proteína mostrou compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras toxinas que atuam em canais para K+ depositadas em bancos de dados. Sua massa molar íntegra de 6.571,3165 Da foi determinada por espectrometria de massas. Os ensaios funcionais em células de linhagem de macrófagos peritoneais demonstraram que a Ts19 frag I (50 ?g/mL) estimulou a liberação de óxido nítrico, IL-6 e não foi citotóxica na dose utilizada. Um ensaio para verificar a atividade hemolítica da Ts19 frag I também foi realizado e nas concentrações de 25 ?g/mL e 50 ?g/mL esta não demonstrou atividade citolítica. Nas frações VII e VIII também foram encontradas a Ts2, como um contaminante do pico 22, e a Ts19 frag II, cujo precursor é a Ts19 frag I. A Ts19 frag II presente no pico 19 foi sequenciada e mostrou-se contaminada com a Ts19 frag I. / Poisonings by venomous animals are frequent and almost 35 % of the accidents are caused by scorpions, especially by Tityus serrulatus. The venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus has aroused scientific and medical interest, since it is a complex mixture of mucopolysaccharides, protease inhibitors, histamine, neurotoxins and other components. The neurotoxins are the main responsible for the symptoms of poisoning by having high affinity and selectivity for voltage-sensitive ion channels. In addition to inducing neurotransmitter release, neurotoxins are also able to stimulate the release of cytokines, especially in cases of severe poisoning. The objectives of this study focused on the isolation and characterization of a novel toxin, named Ts19 fragment I (Ts19 frag I) present in fractions VII and VIII obtained by chromatography of Tityus serrulatus venom on CM-cellulose-52 column. Among the predominant components of these fractions are Ts4, a non-toxic peptide that induces allergic reactions, and Ts3-KS, which interact with sodium channels and was able to induce the release of IL-6. Fractions VII and VIII were applied to C18 reverse phase column (4.6 x 250 mm) and the peaks 19, 22 (Ts19 frag I) and 23 were rechromatographed on C18 (2.1 x 250 mm) column. Sequencing by Edman degradation allowed the determination of 57 amino acid residues of Ts19 frag I, including six cysteine residues. This protein showed to share a high degree of sequence identity with other toxins acting on K+ channels deposited in databases. Its full molar mass of 6.571,3165 Da was determined by mass spectrometry. The functional assays in cell line of peritoneal macrophages showed that Ts19 frag I (50 ?g/mL) stimulated the release of nitric oxide, IL-6 and was not cytotoxic in the dose used. A test to verify the hemolytic activity of Ts19 frag I was also performed and concentrations of 25 ?g/mL and 50 ?g/mL of toxin showed no cytolytic activity. In the fractions VII and VIII were also found Ts2, as a contaminant of the peak 22, and Ts19 frag II, whose precursor is the Ts19 frag I. The Ts19 frag II present in peak 19 was sequenced and showed to be contaminated with Ts19 frag I.

Os peptídeos Antimicrobianos são componentes da imunidade inata de organismos procariotos e eucariotos, e são utilizados na primeira linha da defesa imune desses organismos. Neste trabalho, nós avaliamos os efeitos da peçonha de Tityus serrulatus (PTs) e de sua principal toxina, a TsTX-I, uma -neurotoxina, no crescimento dos fungos. A TsTX-I foi isolada da PTs por cromatografia de troca iônica. Sua pureza foi confirmada por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (C18). A inibição do crescimento de diferentes fungos filamentosos (Neurospora crassa, Penicillum ochrochloron, Penicillum verrucosum, Penicillum waksmanii, Penicillum corylophilum, Penicillum veridicatum, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus phoenix, Aspergillus fumigatus e Talaromyces flavus) foi avaliada por ensaio quantitativo em leitor de microplacas como descrito por (Broekaert et al., 1990). A PTs (100 e 500 g) foi mais ativa na inibição do crescimento de A. nidulans, A. terreus, P. verrucosum e P. corylophilum. A TsTX-I (6, 3, 1,5 e 0,7 g) mostrou atividade antifúngica dose-dependente contra A. nidulans, inibindo até 100% o crescimento em concentrações superiores a 3 g/poço. A inibição do crescimento de A. nidulans foi mais intensa quando a TsTX-I foi adicionada ao meio de cultura no tempo inicial do que após 6 h de germinação livre. A adição de íons Ca++ ao meio de cultura potencializou a ação da TsTX-I contra A. nidulans, P. verrucosum e P.corylophilum. Ensaios realizados na presença de um conhecido bloqueador de canais para Na+, a Tetrodotoxina, mostraram que esta não foi capaz de interferir na atividade antifúngica da TsTX-I. A TsTX-I induz despolarização em terminações nervosas por alterar o mecanismo de ativação de canais para sódio e peptídeos da peçonha de escorpiões que atuam como desestabilizadores de membrana parecem ser parte de um sistema de defesa antibacteriano e antifúngico destes animais. É provável que a TsTX-I induza a despolarização das membranas dos fungos e este efeito pode estar, pelo menos em parte, relacionado à sua atividade antifúngica. / Antimicrobial peptides appear to be ubiquitous and multipotent components of the innate immune defense arsenal used by both prokaryotic and eukaryotic organisms. They are used in the first line of immune defense. In this work, we evaluate the effects of Tityus serrulatus venom (Tsv) and its major toxin TsTX-I, a -neurotoxin, on fungi growth. TsTX-I was isolated from Tsv by ion-exchange chromatography. Its purity was confirmed by reverse-phase (C18) high performance liquid chromatography. The growth inhibition of different filamentous fungi (Neurospora crassa, Penicillum ochrochloron, Penicillum verrucosum, Penicillum waksmanii, Penicillum corylophilum, Penicillum veridicatum, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus phoenix, Aspergillus fumigatus, and Talaromyces flavus ) was evaluated by quantitative microplate reader assay (Broekaert et al., 1990). Tsv (100 g and 500 g) was more active in inhibiting growth of A. nidulans, A. terreus, P. verrucosum and P. corylophilum. TsTX-I (6 g, 1.5 g and 0.7 g) showed dose-dependent antifungal activity against A. nidulans, inhibiting 100% of fungal growth at concentration of 3 g/well. The growth inhibition of A. nidulans was more intense when TsTX-I was added to culture medium at the initial time than after 6 h of free germination. The addition of Ca++ ions on culture medium increased TsTX-I action against A. nidulans, P. verrucosum and P. corylophilum. Assays carried out in the presence of tetrodotoxin, a known Na+ channel blocker, showed that it was not able to interfere on TsTX-I antifungal activity against A. nidulans. TsTX-I induces depolarization on nerve endings and it is known that the action of membrane destabilizing peptides in scorpion venoms seems to be part of an antibacterial and antifungal defense system. It is probably that TsTX-I induces depolarization of fungi membranes and this effect is, at least in part, responsible for its antifungal activity.

Este trabalho relata o isolamento e caracterização bioquímica parcial de componentes do veneno de Tityus serrulatus (VTs) com ação sobre o sistema complemento (SC). O procedimento de purificação envolveu uma cromatografia de troca iônica do VTs em CM-celulose-52, em pH 7,8 e doze frações foram obtidas, denominadas de I a XIII. A fração I, que apresenta atividade sobre o SC sérico, foi filtrada em Sephacryl S-200 e dez subfrações foram obtidas e denominadas I-1 a I-10. A subfração I-1 foi recromatografada em uma coluna de DEAE-Sepharose, em pH 7,8. Cinco subfrações foram obtidas (DE-1 a DE-5) e as subfrações DE-2, DE-3 e DE-4 incubadas com soro humano normal (SHN) induziram redução da atividade lítica da via clássica/lectina (VC/L) de forma concentração-dependente. A subfração DE-2 apresentou uma banda eletroforética única no gel de eletroforese de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), com peso molecular (PM) de aproximadamente 247.000 na ausência de b-mercaptoetanol e seis bandas na presença de b-mercaptoetanol. O procedimento de purificação dos componentes ativos da subfração I-4 envolveu basicamente uma cromatografia de troca iônica em Mono-Q, em pH 7,1. Sete subfrações (MQ-1 a MQ-7) foram obtidas neste passo cromatográfico. As proteínas MQ-5 e MQ-7 da subfração I-4 induziram redução da atividade hemolítica das VC/L e via alternativa (VA). Com o objetivo de investigar o mecanismo de ação sobre o SC, SHN foi incubado com a subfração I-4 ou seus componentes (MQ-5 e MQ-7). A imunoeletroforese mostrou a clivagem do fator B e de C3 por estas proteínas, similar ao induzido pela incubação de SHN com zimosan, o que confirma a hipótese de que MQ-5 e MQ-7 induzem a ativação do SC. A capacidade de gerar fatores quimiotáticos no soro foi investigada. Nas condições experimentais, a incubação de SHN com a subfração I-4, proteínas MQ-5 e MQ-7 induziu a migração de neutrófilos similar a induzida pela incubação de soro com zimosan, demonstrando que estas proteínas induzem clivagem de C3 e C5, gerando os fragmentos ativos de C3a e C5a. As proteínas MQ-5 e MQ-7 não foram capazes de lisar eritrócitos de coelho e carneiro. MQ-5 e MQ-7 não induziram redução da atividade hemolítica da VC/L após o aquecimento a 100ºC, portanto a ação destas proteínas não é conseqüência da presença de produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS). As proteínas MQ-5 e MQ-7 apresentaram atividade fibrinogenolítica e caseinolítica e são metaloproteases, já que a atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina. Ambas proteínas apresentaram uma banda eletroforética única por SDS-PAGE, com um PM aproximado de 24.500 na ausência de b-mercaptoetanol, 33.100 na presença de b-mercaptoetanol e um ponto isoelétrico de 4,2. A seqüência N-terminal (Degradação de Edman) e a seqüência de peptídeos trípticos (Espectrometria de massa ESI-MS/MS) de MQ-5 e MQ-7 foram determinadas. Ambas proteínas apresentaram seqüência similar de aminoácidos. Em resumo, este trabalho mostrou que o VTs contém proteases (MQ-5 e MQ-7, metaloproteases) que são capazes de ativar o SC e podem ser importantes no processo inflamatório que ocorre em conseqüência do envenenamento. Além disso, estas proteínas podem ser usadas para depledar o SC em modelos experimentais de doenças em que este sistema está envolvido. / This work reports the isolation and partial biochemical characterization of components from Tityus serrulatus venom (TsV) with action on the complement system (CS). The purification procedure involved an ion-exchange chromatography of TsV on CM-celullose-52, at pH 7.8, twelve fractions were obtained and named I to XIII. Fraction I, showing activity on the serum CS, was filtered on Sephacryl S200 and ten subfractions were obtained and denominated I-1 to I-10. The subfraction I-1 was rechromatographed on a column of DEAE-sepharose, at pH 7.8. Five subfractions were obtained (DE-1 to DE-5) and subfractions DE-2, DE-3 and DE-4 incubated with NHS induced a concentration-dependent reduction in lytic activity of CP/L. Subfraction DE-2 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with a molecular weight (MW) of approximately 247,000 in the absence of -mercaptoethanol and six bands in the presence of -mercaptoethanol. The purification procedure of the active compounds of subfraction I-4 involved basically an ion-exchange chromatography on Mono-Q, at pH 7.1. Seven subfractions (MQ-1 to MQ-7) were obtained in this chromatography step. We found that proteins MQ-5 and MQ-7 of subfraction I-4 induced reduction in hemolytic activity for CP/L and AP. In order to investigate the mechanism of action on the CS, NHS was incubated with subfraction I-4 or its components (MQ-5 and MQ-7). The immunoelectrophoresis showed cleavage of factor B and C3 by these proteins, similar to that induced by incubation of NHS with zymosan, which corroborated the hypothesis that MQ-5 and MQ-7 induce activation of the CS. Their capacitiy to elicit serum-induced chemotaxis was then investigated. Under our assay conditions, incubation of NHS with subfraction I-4, protein MQ-5 and MQ-7 induced neutrophil migration similar to that induced by incubation of serum with zymosan, showing that the proteins induce cleavage of C3 and C5, thereby generating the active fragments C3a and C5a. Proteins MQ-5 and MQ-7 alone were unable to lyse rabbit or sheep erythrocytes. MQ-5 and MQ-7 did not induce reduction in hemolytic activity for CP/L after being heated to 100ºC, therefore the action of these proteins is not a consequence of the presence of bacterial products, such as lipopolyssaccharides (LPS). Proteins MQ-5 and MQ-7 showed fibrinogenolytic and caseinolytic activities and they probably are metalloproteases, since its fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenantroline. Both MQ-5 and MQ-7 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with an approximate MW of 24,500 in the absence of -mercaptoethanol, 33,100 in the presence of -mercaptoethanol and an isoelectric point of 5.9. The N-terminal sequence (Edman Degradation) and the sequence of tryptic peptides (Mass spectrometry- ESI-MS/MS) from MQ-5 e MQ-7 were determined. The proteins MQ-5 e MQ-7 showed similar sequence of aminoacids. In summary, this work showed that the TsV venom contains proteases (MQ-5 and MQ-7, metalloproteases) which are able to activate the CS, and may therefore be important in the context of the inflammatory process occurring in consequence of envenomation. In addition these proteins may be used to deplete complement in experimental models of diseases involving participation of this system.

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / According to the Brazilian Ministry of Health, about 8000 cases of scorpion envenomation are reported yearly in Brazil. Most cases are due to the sting of Tityus serrulatus, known popularly as yellow scorpion. It belongs to the Arachnidea, class, Scorpionidae order, Buthidae family, Tityinae subfamily and Tityus genus. It is present in the Brazilian States of Minas Gerais, EspÃrito Santo, Bahia, Rio de Janeiro, SÃo Paulo, ParanÃ, GoiÃs, Mato Grosso do Sul and Ceara and it is the most dangerous scorpion in Brazil, causing severe envenoming and even death. The effects of T. serrulatus venom (TsV) on the renal physiology in humans consist of increased renal parameters such as urea and creatinine. So far, effects had not been tested in the perfused rat kidney. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250 to 300g, were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of previously dialysed bovine albumin. The effects of T. serrulatus venom in the 1, 3 and 10 &#956;g/mL concentrations, were studied on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR), sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-). Tityus serrulatus venom was added to the system after 30 minutes of internal control; it increased PP (PP30â = 112.4  2.0 vs PP60â = 145.8  17.4mmHg*,*p<0.05) and RVR (RVR30â = 5.88  0.33 vs RVR60â = 7.52  0.86mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0.05), decreased GFR (GFR30â = 0.671  0.076 vs GFR120â = 0.467  0.062mL.g-1.min-1*,*p<0.05) and UF (UF30â = 0.147  0.011 vs UF90â = 0.119  0.013mL.g-1.min-1*,*p<0.05). The mesenteric bed was perfused with Krebs solution kept warm at 37ÂC by a constant flow (4mL/min), while the variable perfusion pressure was measured by means of a pressure transducer. The vascular effects of T. serrulatus venom were examined and compared to the infusion of the perfuse solution. The infusion of T. serrulatus venom (10&#956;g/mL/min) increased the basal perfusion pressure of isolated arteriolar mesenteric bed (basal pressure = 74.17  3.42 vs TsV = 151.8  17.82 mmHg*,*p<0.05). The histopathological evaluation revealed deposits of protein in the renal tubules and urinary spaces of kidneys perfused with TsV. This may reveal that there has been a perfusate extravasation to the parenchyma probably due to increase of hydrostatic pressure induced by TsV. T. serrulatus venom affects renal hemodynamics increasing resistance and perfusion pressure, determining extravasation of perfusate and decreasing the glomerular filtration rate and renal flow. / No Brasil, sÃo notificados, anualmente, cerca de 8.000 acidentes escorpiÃnicos. A espÃcie Tityus serrulatus, popularmente conhecido como escorpiÃo amarelo, pertence à classe Arachnidea, ordem Scorpionidae, familia Buthidae, subfamÃlia Tityinae, gÃnero Tityus. à encontrado nos estados de Minas Gerais, EspÃrito Santo, Bahia, Rio de Janeiro, SÃo Paulo, ParanÃ, GoiÃs, Mato Grosso do Sul e CearÃ, sendo responsÃvel pelos acidentes com maior gravidade e letalidade. Os efeitos do veneno de T. serrulatus (VTs), sobre a fisiologia renal humana, mostraram aumentar os parÃmetros renais, urÃia e creatinina. Entretanto, na perfusÃo de rins de ratos, os efeitos nÃo haviam sido testados atà agora. O objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos renais e a reatividade vascular induzidos pelo veneno do escorpiÃo Tityus serrulatus. Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com SoluÃÃo de Krebs-Hanseleit contendo 6g% de albumina bovina previamente dialisada. Os efeitos de veneno de T. serrulatus, nas concentraÃÃes de 1, 3 e 10 &#956;g/mL (n=6), foram estudados sobre a PressÃo de PerfusÃo (PP), ResistÃncia Vascular Renal (RVR), Fluxo UrinÃrio (FU), Ritmo de FiltraÃÃo Glomerular (RFG), Percentual de Transporte Tubular de SÃdio (%TNa+), de PotÃssio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). O veneno de T. serrulatus foi adicionado apÃs 30 minutos de controle interno e aumentou a PP (PP30â = 112,4  2,0 vs PP60â = 145,8  17,4mmHg*,*p<0,05), a RVR (RVR30â = 5,88  0,33 vs RVR60â = 7,52  0,86mmHg/mL.g-1.min-1*,*p<0,05) e diminuiu o RFG (RFG30â = 0,671  0,076 vs RFG120â = 0,467  0,062mL.g-1.min-1*,*p<0,05) e o FU (FU30â = 0,147  0,011 vs FU90â = 0,119  0,013mL.g-1.min-1*,*p<0,05). O leito mesentÃrico foi perfundido, com soluÃÃo de Krebs, sob a temperatura de 37ÂC, a um fluxo constante (4mL/min), enquanto a pressÃo de perfusÃo era mensurada atravÃs de um transdutor de pressÃo. Os efeitos vasculares do veneno de T. serrulatus 10&#956;g/mL/min; n = 6) foram examinados e comparados com a infusÃo apenas da soluÃÃo perfusora. A infusÃo do veneno de T. serrulatus aumentou a pressÃo basal de perfusÃo do leito mesentÃrico isolado (pressÃo basal: 74,17  3,42 vs VTs 151,8  17,82mmHg*, *p<0,05). A avaliaÃÃo histolÃgica revelou depÃsitos de proteÃnas nos tÃbulos renais e nos espaÃos urinÃrios dos rins perfundidos com o veneno de T. serrulatus. Isso pode revelar que houve um extravasamento do perfusato para o parÃnquima, devido, provavelmente, ao aumento da pressÃo hidrostÃtica promovida por VTs. O veneno de T. serrulatus, entÃo, promove efeitos hemodinÃmicos renais que elevam a resistÃncia e a pressÃo de perfusÃo, forÃando a passagem de proteÃnas para os tÃbulos e diminuindo o ritmo de filtraÃÃo glomerular e o fluxo urinÃrio.

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

Este trabalho relata o isolamento e caracterização bioquímica parcial de componentes do veneno de Tityus serrulatus (VTs) com ação sobre o sistema complemento (SC). O procedimento de purificação envolveu uma cromatografia de troca iônica do VTs em CM-celulose-52, em pH 7,8 e doze frações foram obtidas, denominadas de I a XIII. A fração I, que apresenta atividade sobre o SC sérico, foi filtrada em Sephacryl S-200 e dez subfrações foram obtidas e denominadas I-1 a I-10. A subfração I-1 foi recromatografada em uma coluna de DEAE-Sepharose, em pH 7,8. Cinco subfrações foram obtidas (DE-1 a DE-5) e as subfrações DE-2, DE-3 e DE-4 incubadas com soro humano normal (SHN) induziram redução da atividade lítica da via clássica/lectina (VC/L) de forma concentração-dependente. A subfração DE-2 apresentou uma banda eletroforética única no gel de eletroforese de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), com peso molecular (PM) de aproximadamente 247.000 na ausência de b-mercaptoetanol e seis bandas na presença de b-mercaptoetanol. O procedimento de purificação dos componentes ativos da subfração I-4 envolveu basicamente uma cromatografia de troca iônica em Mono-Q, em pH 7,1. Sete subfrações (MQ-1 a MQ-7) foram obtidas neste passo cromatográfico. As proteínas MQ-5 e MQ-7 da subfração I-4 induziram redução da atividade hemolítica das VC/L e via alternativa (VA). Com o objetivo de investigar o mecanismo de ação sobre o SC, SHN foi incubado com a subfração I-4 ou seus componentes (MQ-5 e MQ-7). A imunoeletroforese mostrou a clivagem do fator B e de C3 por estas proteínas, similar ao induzido pela incubação de SHN com zimosan, o que confirma a hipótese de que MQ-5 e MQ-7 induzem a ativação do SC. A capacidade de gerar fatores quimiotáticos no soro foi investigada. Nas condições experimentais, a incubação de SHN com a subfração I-4, proteínas MQ-5 e MQ-7 induziu a migração de neutrófilos similar a induzida pela incubação de soro com zimosan, demonstrando que estas proteínas induzem clivagem de C3 e C5, gerando os fragmentos ativos de C3a e C5a. As proteínas MQ-5 e MQ-7 não foram capazes de lisar eritrócitos de coelho e carneiro. MQ-5 e MQ-7 não induziram redução da atividade hemolítica da VC/L após o aquecimento a 100ºC, portanto a ação destas proteínas não é conseqüência da presença de produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS). As proteínas MQ-5 e MQ-7 apresentaram atividade fibrinogenolítica e caseinolítica e são metaloproteases, já que a atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina. Ambas proteínas apresentaram uma banda eletroforética única por SDS-PAGE, com um PM aproximado de 24.500 na ausência de b-mercaptoetanol, 33.100 na presença de b-mercaptoetanol e um ponto isoelétrico de 4,2. A seqüência N-terminal (Degradação de Edman) e a seqüência de peptídeos trípticos (Espectrometria de massa ESI-MS/MS) de MQ-5 e MQ-7 foram determinadas. Ambas proteínas apresentaram seqüência similar de aminoácidos. Em resumo, este trabalho mostrou que o VTs contém proteases (MQ-5 e MQ-7, metaloproteases) que são capazes de ativar o SC e podem ser importantes no processo inflamatório que ocorre em conseqüência do envenenamento. Além disso, estas proteínas podem ser usadas para depledar o SC em modelos experimentais de doenças em que este sistema está envolvido. / This work reports the isolation and partial biochemical characterization of components from Tityus serrulatus venom (TsV) with action on the complement system (CS). The purification procedure involved an ion-exchange chromatography of TsV on CM-celullose-52, at pH 7.8, twelve fractions were obtained and named I to XIII. Fraction I, showing activity on the serum CS, was filtered on Sephacryl S200 and ten subfractions were obtained and denominated I-1 to I-10. The subfraction I-1 was rechromatographed on a column of DEAE-sepharose, at pH 7.8. Five subfractions were obtained (DE-1 to DE-5) and subfractions DE-2, DE-3 and DE-4 incubated with NHS induced a concentration-dependent reduction in lytic activity of CP/L. Subfraction DE-2 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with a molecular weight (MW) of approximately 247,000 in the absence of -mercaptoethanol and six bands in the presence of -mercaptoethanol. The purification procedure of the active compounds of subfraction I-4 involved basically an ion-exchange chromatography on Mono-Q, at pH 7.1. Seven subfractions (MQ-1 to MQ-7) were obtained in this chromatography step. We found that proteins MQ-5 and MQ-7 of subfraction I-4 induced reduction in hemolytic activity for CP/L and AP. In order to investigate the mechanism of action on the CS, NHS was incubated with subfraction I-4 or its components (MQ-5 and MQ-7). The immunoelectrophoresis showed cleavage of factor B and C3 by these proteins, similar to that induced by incubation of NHS with zymosan, which corroborated the hypothesis that MQ-5 and MQ-7 induce activation of the CS. Their capacitiy to elicit serum-induced chemotaxis was then investigated. Under our assay conditions, incubation of NHS with subfraction I-4, protein MQ-5 and MQ-7 induced neutrophil migration similar to that induced by incubation of serum with zymosan, showing that the proteins induce cleavage of C3 and C5, thereby generating the active fragments C3a and C5a. Proteins MQ-5 and MQ-7 alone were unable to lyse rabbit or sheep erythrocytes. MQ-5 and MQ-7 did not induce reduction in hemolytic activity for CP/L after being heated to 100ºC, therefore the action of these proteins is not a consequence of the presence of bacterial products, such as lipopolyssaccharides (LPS). Proteins MQ-5 and MQ-7 showed fibrinogenolytic and caseinolytic activities and they probably are metalloproteases, since its fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenantroline. Both MQ-5 and MQ-7 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with an approximate MW of 24,500 in the absence of -mercaptoethanol, 33,100 in the presence of -mercaptoethanol and an isoelectric point of 5.9. The N-terminal sequence (Edman Degradation) and the sequence of tryptic peptides (Mass spectrometry- ESI-MS/MS) from MQ-5 e MQ-7 were determined. The proteins MQ-5 e MQ-7 showed similar sequence of aminoacids. In summary, this work showed that the TsV venom contains proteases (MQ-5 and MQ-7, metalloproteases) which are able to activate the CS, and may therefore be important in the context of the inflammatory process occurring in consequence of envenomation. In addition these proteins may be used to deplete complement in experimental models of diseases involving participation of this system.