O veneno de C. d. terrificus tem sido descrito como sendo de pouca complexidade, tendo 4 frações caracterizadas, convulxina, giroxina. crotoxina e crotamina. O presente trabalho visou o isolamento e caracterização da Delta toxina cuja existência havia sido aventada em trabalhos anteriores. Após a realização de uma varredura de tampões em uma coluna de exclusão molecular Superdex-75 acoplada a um sistema FPLC, na presença de três diferentes tampões, chegou-se a uma condição ideal de fracionamento do veneno crotálico. Em seqüência realizou-se a segunda etapa de purificação em sistema HPLC em uma coluna C4, onde foi possível identificar o pico de interesse. O pico puro passou por análises em MALDI-ToF sendo sua massa estimada em 14.074,92 Da, Quando analisado por eletroforese em gel de poiiacrilamida, a delta toxina apresentou massa molecular de cerca de 14 kDa e uma migração anômala, Por eletroforese 2D, a proteína apresentou caráter ácido, com pl entre 4 e 5 e massa molecular de aproximadamente 42 kDa, revelando \"spots\" muito semelhantes podendo ser isoformas com características de uma proteína glicosiiada. Após digestão dos spots com tripsina, os fragmentos foram confrontados com o banco de dados do \"swissprot\", mostrando alto grau de homologia \"até 43% de cobertura\" com a troca ri na, um ativador de protrombina do veneno de Tropidechis carinatus, esses dados foram confirmados com a análise de aminoácidos. De posse desses resultados, optou-se por testar a capacidade da fração purificada de ativar fator X e II, usando substratos sintéticos. Os resultados apontaram para uma ativação direta do fator X, uma vez que não houve ativação do fator II, atividade que também não foi detectada no veneno total. A mesma se mostrou um potente ativador da agregação de forma direta, uma vez que os ensaios de agregação plaquetária foram realizados com plaquetas lavadas, logo na ausência de fatores séricos. Quando os ensaios de agregação foram realizados na presença de alguns inibidores observou-se que nem a atividade metalo proteinase, nem a serino proteinase, tampouco um domínio lectina estavam envolvidos no processo, uma vez que EDTA, benzamidina e D-galactose não inibiram a atividade da proteína. No presente trabalho isolamos a Delta toxina do veneno de C. d. terrificus. A mesma se comportou como previsto por Vital Brazil em 1980, eluindo na posição por ele aventada, sendo uma proteína ativadora de Fator X que ativa agregação plaquetária mesmo em concentrações muito baixas e de massa molecular de 40 kDa levando nos a crer se tratar de um homotrímero cujos componentes são unidos por ligações fracas. / The Crotalus durissus terrificus venom has been so far described as being of low complexity, with four major components described: convulxin, gyroxin, crotoxin and crotamine. In recent studies, other components of this venom were characterized as, for example, an analgesic factor. In 1980, Vital Brazil predicted the existence of a toxin which could be involved in platelet aggregation, and named it delta toxin. However, this toxin has never been isolated or characterized. The aim of the present work was to purify and characterize this toxin. After FPLC size exclusion chromatography followed by reverse phase HPLC, an homogeneous fraction was obtained, with a molecular weight of 14,074.92 Da. When analyzed by SOS-PAGE, this toxin presented an anomalous behavior, with a molecular weight of 14 kDa, while in 2D gels, spots around 40 kDa and with an isoelectrical point between 4 and 5 were observed suggesting isoforms with glicosilation microheterogeneity. After trypsin digestion, the fragments were submitted to the swissprot databank showing high homology (43% coverage, 15 matching peptides) with trocarin, a prothrombin activator from Tropidechis carinatus. These data were further confirmed by aminoacid analysis. The toxin was tested for its ability to activate factor II and X using synthetic substrates. Our data indicate a direct activation of factor X. The same toxin also behaved as a potent direct platelet aggregation activator on washed platelets. Assays with specific inhibitors indicate that neither metalloproteinase, nor serinoproteinase or t lectin domains are involved in the aggregating activity, since EDTA, benzamidin and D-galactose did not inhibit the toxin. In the present work, we were able to identify, purify and characterize a new toxin from the brazilian rattlesnake. It behaved as predicted by Vital-Brazil and displayed direct factor X activating properties, also inducing platelet aggregation, even at low concentrations. Our data also indicate that it is probably a homotrimer with the subunities linked by hydrophobic and/or electrostatic interactions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14052012-135435 |
| Date | 25 August 2006 |
| Creators | Campos, Lucélia de Almeida |
| Contributors | Spencer, Patrick Jack |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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