Orientador: Julia Prado Franceschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T18:08:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tarsitano_ChristianeAparecidaBadin_M.pdf: 3776401 bytes, checksum: da949a6570ac85fc05d84aa93ee16374 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Este trabalho objetivou demonstrar que entre as toxinas crotálicas, só a convulxina é capaz de causar trombose pulmonar em camundongos e buscou, ao mesmo tempo, investigar o mecanismo pelo qual a convulxina produz a trombose pulmonar. A convulxina, isolada tanto do veneno de C. d. terrificus como da C. d cascavel/a, mostrou ser a única capaz de agregar plaquetas e evocar a formação de trombos em pulmões de camundongos. Como não houve diferença entre o grau de trombose causado pela convulxina das duas subespécies, os resultados obtidos com cada uma, em separado, foram agrupados. Na tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na trombose, utilizamos não só os inibidores clássicos da agregação via tromboxano Az (AAS e Dazoxiben), como também a prostaciclina, capaz de elevar os níveis intracelulares de AMPc. Usamos também inibidores da trombina (heparina) e antagonistas ensaiados, anteriormente, na agregação e/ou broncoconstrição, induzidas pela convulxina (metisergida, mepiramina e metronidazol). Os resultados obtidos levam-nos às seguintes conclusões: a convulxina, poderoso agente agregante plaquetário in vitro, induz à formação de trombos no pulmão de camundongos; tanto a heparina, como a aspirina, a prostaciclina e o dazoxiben mostraramse capazes de inibir o efeito trombótico da convulxina, sozinhos ou em associaç~o; a heparina potencializou os efeitos das demais drogas e o seu efeito antitrombótico foi potencializado pela associação com o dermatan. O modelo é autolimitado, pois não admite a possibilidade de aumento de dose da convulxina / Abstract: Convulxin is a high molecular weight, non-enzymatic, platelet aggregating protein present in the venom of South American rattlesnake, Crotalus durissus terrificus. In this work, we investigatd the ability of convulxin to cause pulmonary thrombosis in mice after intravenous injection and examined the possible mechanism (s) involved using specific inhibitors. Convulxin was purified ftom C. d. cascavella e C. d terrificus venom by chromatography on Sephadex G-75 in 0.005 M ammonium formate, ph 3.5. Male Swiss mice were injected i.v. with varying doses of convulxin and then euthanized 30 minoLater after wich the lungs were rapidly removed, fixed and processed for histological analysis to determine the ftequency of pulmonary thrombosis. Human platelet-rich plasma was prepared by standart differential centrifugation. Convulxin ftom C. d cascavella e C. d terrificus venoms aggregated hurnan platelet at concentrations 8 ng/ml and cause pulmonary thrombosis at doses20 ~g/kg. The latter was dose-dependent at doses up to 400 ~g/kg, but decreased at higher dose (up to 1000 ~g/kg) which produced the convulsions characteristic of.this toxin. In no caso did the ftequency ofthrombi (expressed as the percentage of vessels occuded with thrombi) exceed 70%. Histological examination by light microscopy showed that there was no thrombus formation in other organs such as heart, kidney and tiver. Heparin and dermatan (anionic molecules) were partially effective at preventing the thrmbotic action of convulxin, particularlyat low doses of the latter, perhaps through a direct electrostatic interaction with convulxin. Mepyramine (histaminer H2 , receptorantagonist), methysergide (5-HT receptor antagonist) and metronidazole há no effect on the formation of thrombi induced by convulxin. Sirnilary, prostacyclin, which increases intracelular cAMP levels, dazoxiben, a thromboxane A2 synthase inhibitor, and aspirin, a cyc100xygenase inhibitor, did not inhibit convulxin-induced thrombosis. These results suggest that is no direct reationship between the platelet aggregation and the convulsions produced by convulxin and that mediators known to affect convulxin-induce aggregation do not affect the thrombotic activity, perhaps because these actions involve different pathways / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador : Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:16:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcondes_Sisi_M.pdf: 1350122 bytes, checksum: f4aa256f4d95f590a00d37a6de099465 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: O objetivo desta tese foi caracterizar farmacologicamente a ativação plaquetária induzida pela polilisina (poliaminoácido básico) em plasma rico em plaquetas ou plaquetas lavadas humanas e verificar a influência dos sítios aniònicos na ativação plaquetária induzida por este policátion. A agregação plaquetária foi monitorada utilizando-se um agregômetro Payton ou Chrono-Log e a liberação de TXA2 foi medida através de seu produto de degradação TXB2 por radioimunoensaio. O perfil do sulfato de condroitina em plaquetas foi analisado através de eletroforese em gel de agarose. Em PRP polilisina induziu agregação dependente da concentração e do peso molecular do policátion. Esta agregação foi acompanhada pela liberação de TXA2 e inibida por nitroprussiato de sódio e iloprost. Antagonistas de receptores de plaquetas para ADP, adrenalina, PAF e colágeno não modificaram a agregação induzida por polilisina em PRP. Em PL o efeito de polilisina também foi dependente do peso molecular do policátion. Este efeito não foi inibido por EDTA, iloprost e apenas parcialmente por SNP e não foi acompanhado por liberação de TXA2. Poliânions como o ácido poliglutâmico inibiram o efeito de polilisina quando adicionado antes ou depois deste evento. A agregação de polilisina em PRP ou o efeito deste policátion em PL não foram modificados por heparinase, heparitinase I ou heparitinase II, contrariamente, a condroitinase inibiu de maneira dose-dependente a agregação em PRP, mas não modificou o efeito deste poliaminoácido básico em PL. Nossos resultados demonstraram que a polilisina induz agregação em PRP, mas não em plaquetas lavadas. A agregação induzida pela polilisina em PRP deve-se a carga catiônica do policátion e depende parcialmente da presença de sulfato de condroitina na membrana plaquetária. Em plaquetas lavadas, a aglutinação induzida pela polilisina não se deve à interação com sulfato de condroitina. Estes resultados levam a hipótese que o sulfato de condroitina apresenta características de receptor plaquetário, visto que a interação eletrostática com um policátion, como a polilisina, leva a um fenômeno de ativação metabólica. A expressão de sítios aniônicos das plaquetas pode desta maneira modular sua reatividade aos diversos agonistas / Abstract: The aim of this thesis was to pharmacologically characterize the platelet aggregation induced by polylysine, a polyamino acid, in human platelet-rich plasma (PRP) and in washed platelets (WP) and to examine the importance of cell membrane anionic sites in mediating the responses to this polycation. Platelet aggregation was monitored using a two-channel Payton or a one- channel Chrono-Log aggregometer. The release of TXA2 by stimulated platelets was quantified by measuring the levels of its degradation product TXB2 using an appropriate radioimmunoassay. The platelet membrane chondroitin sulfate profile was determined by agarose gel electrophoresis. In PRP, polylysine induced a concentration- and molecular weight- dependent aggregation which was accompanied by the release of TXA2 and was inhibited by sodium nitroprusside {SNP) and iloprost. Antagonists to platelet receptors for ADP, adrenaline, collagen and platelet activating factor (PAF) had no influence on the aggregation induced by polylysine. In WP, the aggregation induced by polylysine was also dependent on the polycation molecular weight. This response was not inhibited by EDTA or iloprost but was partially inhibited by SNP. There was no accompanying formation of TXA2. Polyanions such as polyglutamic acid inhibited or reversed the action of polylysine when added before or after the polycation, respectively. Neither the aggregation induced by polylysine in PRP nor the response induced in WP was modified by preincubation of the platelets with heparinase, heparitinase I or heparitinase II. In contrast, chondroitinase dose-dependently inhibited the aggregation in PRP but had no effect on the response in WP. These results suggest that polylysine induces aggregation in PRP but not in WP. The aggregation in PRP is due to the cationic charge of the polycation and depends, at least in part, on the presence of chondroitin sulfate in the platelet membrane. In WP, the agglutination induced by polylysine does not involve an interaction with chondroitin sulfate. These observations indicate that chondroitin sulfate may function as a type of platelet membrane receptor since the electrostatic interaction of a polycation such as polylysine can lead to metabolic activation of these cells. The expression of anionic sites on the surface of the platelet membrane could therefore be a means by which the platelet regulates its responsiveness to a variety of agonists / Mestrado / Mestre em Farmacologia

A busca de plantas medicinais com potencial para o alívio de dores e até mesmo a cura de doenças tem se expandido em diversos países, inclusive no Brasil. O Brasil é um grande produtor de maracujá, que além do seu valor nutricional de seus frutos, tem sido utilizado também com finalidade terapêutica, na medicina popular. Além das diversas aplicações do chá das folhas de maracujá na medicina popular, alguns autores têm sugerido também as atividades hipoglicemiante, antioxidante, anti-glicante e antiagregante de plaquetas para extratos de folhas obtidos de diferentes espécies de maracujá. No entanto, o papel modulatório do extrato bruto seco de folhas P. edulis Sims sobre a glicação proteica e ativação plaquetária não está totalmente esclarecido. O diabetes mellitus é considerado como um importante problema de saúde pública, devido à sua elevada prevalência, ao desenvolvimento de complicações crônicas incapacitantes e ao alto custo econômico gerado pelo seu tratamento. Estudos desenvolvidos com diferentes modelos experimentais têm demonstrado que o DM leva à ativação de plaquetas com consequente aumento de sua agregação bem como ao aumento da glicação de proteínas, sendo estas alterações diretamente envolvidas nas vias bioquímicas que levam ao desenvolvimento das principais complicações crônicas induzidas pelo DM. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo geral determinar o teor de polifenóis totais e avaliar os efeitos do extrato seco das folhas de Passiflora edulis Sims sobre marcadores bioquímicos, a glicação de colágeno, a ativação e a agregação plaquetária em ratos diabéticos. Ratos machos Wistar (300 ± 25g) foram tratados com aloxano (150mg/Kg de peso corporal dissolvido em salina 0,9%, via intraperitoneal). As folhas secas de Passiflora edulis Sims foram coletadas no município de Alfenas-MG (21° 27’ 33’’ S; 46° 01’ 59’’ w; Altitude 789 m) e identificadas na Universidade Federal de Lavras-MG. O extrato seco foi obtido por maceração em solução hidroetanólica 70%(V/V), seguida de evaporação sob pressão reduzida e de liofilização. O extrato seco foi diluído em água e administrado por gavagem durante 90 dias após a indução do diabetes (200mg do extrato seco/Kg de peso do animal). O grupo controle recebeu apenas água. A agregação plaquetária foi avaliada em agregômetro da marca PA-04 Qualiterm Eletronica à 37°C. Os marcadores bioquímicos (glicemia, ureia, colesterol total e frações ) foram dosados no soro por métodos enzimáticos e a creatinina foi determinada no soro dos animais pelo método de jaffé modificado ( rastreável ao IDMS). O conteúdo de colágeno glicado foi dosado por fluorescência. A produção de espécies oxidantes foi monitorada por quimiluminescência. A administração do extrato seco de folhas de Passiflora edulis Sims reduziu a glicemia em jejum bem como os níveis de HbA1C no sangue dos animais diabéticos. A administração do extrato seco das folhas de Passiflora edulis Sims impediu o aumento dos níveis de creatinina no soro dos animais diabéticos. O extrato seco das folhas de Passiflora edulis Sims foi capaz de reduzir a concentração de lipoproteínas aterogênicas no soro dos animais tratados. Os animais diabéticos apresentaram maior produção basal de oxidantes e a agregação plaquetária em relação aos animais não diabéticos. O tratamento dos animais diabéticos com o extrato de Passiflora edulis Sims atenuou os efeitos do diabetes sobre a produção de oxidantes e a agregação plaquetária. Os níveis de AGEs determinados em amostras de colágeno obtido do tendão de animais diabéticos foi maior que nos animais não diabéticos e o tratamento dos animais diabéticos com o extrato seco levou a uma redução da glicação do colágeno. / The search for medicinal plants with potential for pain relief and even cure diseases has expanded in several countries, including Brazil. Brazil is a major producer of passion fruit, which is beyond the nutritional value of its fruit, also been used for therapeutic purposes in folk medicine. In addition to the various applications of tea leaves passion in folk medicine, some authors have also suggested the hypoglycemic activity, antioxidant, antiplatelet and anti-platelet glicante for leaf extracts obtained from different species of passion fruit. However, the modulatory role of dry crude extract of leaves P. edulis Sims on protein glycation and platelet activation is not fully understood. Diabetes mellitus is considered as a major public health problem due to its high prevalence, the development of disabling chronic complications and the high economic costs generated by their treatment. Studies carried out with different experimental models have shown that DM leads to platelet activation with consequent increase of aggregation as well as increased glycation of proteins, and these changes directly involved in the biochemical pathways leading to the development of major chronic complications induced by DM . Thus, the present work had as main objective to determine the content of total polyphenols and evaluate the effects of dry extract of Passiflora edulis Sims on biochemical markers of collagen glycation, activation and platelet aggregation in diabetic rats. Male Wistar rats (300±25g) were treated with alloxan (150mg/kg body weight dissolved in 0.9% saline) intraperitoneally. The fresh leaves of passion fruit were collected in Alfenas-MG (21° 27’ 33’’ S; 46° 01’ 59’’ w; Altitude 789 m) and identified at the Federal University of Lavras-MG. The dry extract was obtained by grinding in a hydroethanolic solution 70% (V/V), followed by evaporation under reduced pressure and lyophilization and administered (200mg dry extract / kg) to normal and diabetic rats, for ninety days. The control group received water only. Platelet aggregation was performed in aggregometer PA-04 Qualiterm Eletronica to 37°C. Biochemical markers were determined in serum by enzymatic method. The collagen glycation content will be performed by fluorescence. The oxidant species production was monitored by chemiluminescence. The administration of dry extract of Passiflora edulis Sims leaves reduced fasting glucose and HbA1C levels in the blood of diabetic animals . The dry extract administration of Passiflora edulis Sims prevented the increase of serum creatinine levels of diabetic animals. The dry extract of Passiflora edulis Sims was able to reduce the concentration of atherogenic lipoproteins in the serum of treated animals. Diabetic animals had higher basal production of oxidants and platelet aggregation compared to non-diabetic animals. Treatment of diabetic animals with the extract of Passiflora edulis Sims attenuated the effects of diabetes on oxidant production and platelet aggregation. The AGEs levels determined in samples obtained from tendon collagen from diabetic rats was higher than in non- diabetic animals and the treatment of diabetic animals with dry extract led to a reduction of collagen glycation. / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-23T19:17:46Z No. of bitstreams: 1 2015_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2726609 bytes, checksum: 9b96c0c43e123e5240c0572c1d0bb7d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-05-26T20:23:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2726609 bytes, checksum: 9b96c0c43e123e5240c0572c1d0bb7d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T20:23:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2726609 bytes, checksum: 9b96c0c43e123e5240c0572c1d0bb7d6 (MD5) / Durante o processo inflamatório são ativadas uma quantidade grande de células, entre elas se destacam os leucócitos polimorfonucleares neutrófilos por serem os mais abundantes do sangue periférico (40% a 70% das células brancas) e por chegarem primeiro ao local da injúria tecidual ou local da infecção. O conhecimento dos mecanismos de ativação desse tipo celular torna-se importante para se compreender a regulação imunológica em diversas situações patológicas, sendo algumas destas consequentes à falha na regulação de ativação de polimorfonucleares. Os casos mais comuns encontrados são nas complicações da doença granulomatosa crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome da angústia respiratória aguda, artrite reumatóide e síndrome da resposta inflamatória sistêmica. Pesquisas relataram que o Fator de Agregação Plaquetária (PAF) está relacionado à ativação dos neutrófilos nessas condições, onde o estudo das proteínas e das suas modificações pós traducionais tornam-se pontos centrais para entender a sinalização celular dos neutrófilos nas doenças citadas anteriormente. No presente trabalho foi feito o estudo proteômico de neutrófilos quiescentes com a identificação de mais de 3000 proteínas e de neutrófilos estimulados pelo PAF que revelou um perfil protéico que caracteriza essa estimulação, onde proteínas que fazem parte de processos essenciais tiveram a abundância aumentada como reorganização do citoesqueleto, sinalização intracelular mediada por RAS e Proteina G, subunidades da ATPases vacuolar, e alguns produtos característico do processo inflamatório como NFkβ e prostaglandina E. Por outro lado, como os neutrófilos estão em seu estado estimulado outras proteínas tiveram abundância diminuída, entre elas proteínas responsáveis pelo processo de diferenciação e amadurecimento dos neutrófilos e proteínas que fazem parte do sistema de controle de processos essenciais da célula como síntese de proteínas, metabolismo energético e motilidade celular. A identificação de proteínas acetiladas nos indicou as possíveis proteínas alvos para regulação de importantes vias de estimulação dos neutrófilos como tradução, formação estrutural do núcleo multilobulado dos neutrófilos, transporte de vitaminda B12, assim como em pontos de regulação na síntese de ATP e de subunidades de ATPases. A identificação dessas proteínas com abundância diferencial e acetiladas é de fundamental importância para indicar possíveis alvos terapêuticos de doenças auto-imunes e inflamatórias causadas pelo PAF. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / During the inflammatory process is activated a large number of cells, these include polymorphonuclear neutrophil leukocytes to be the most abundant in the peripheral blood (40% to 70% of white cells) and reaching the first site of tissue injury or local infection. Knowledge of this type of cellular activation mechanisms becomes important to understand the immune regulation in various pathological situations, some of these failed in the subsequent activation of polymorphonuclear regulation. The most common cases are found in the complications of chronic granulomatous disease, chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory distress syndrome, rheumatoid arthritis and systemic inflammatory response syndrome. Research reported that platelet aggregation factor (PAF) is related to the activation of neutrophils such conditions, where the study of proteins and their post-translational modifications become key points to understand cell signaling in neutrophils in the above-mentioned diseases. In the present work was done the proteomic study of quiescent neutrophils with the identification of over 3,000 proteins and neutrophils stimulated by PAF which revealed a protein profile that characterizes this stimulation, in which proteins that are part of key processes had increased abundance as reorganization cytoskeleton, intracellular signaling mediated by Ras and G-protein subunits of vacuolar ATPases, and some typical products of the inflammatory process as NFkβ and prostaglandin E. On the other hand, since neutrophils are stimulated in their state had decreased abundance other proteins, including proteins responsible for the process of differentiation and maturation of neutrophils and proteins that are part of the key process control system of the cell as protein synthesis, metabolism energy and cell motility. The identification of acetylated proteins indicated the possible targets proteins for regulation of important pathways stimulation of neutrophils such as translation, formation of the structural core of the multi-lobed neutrophil, vitaminda B12 transportation, as well as set points in the synthesis of ATP and of subunit ATPases. Identifying these proteins with differential abundance and acetylated is fundamental to indicate possible therapeutic targets for autoimmune and inflammatory diseases caused by PAF.

Os hemoderivados têm sido utilizados com frequência cada vez maior na medicina equina, sendo caracterizados como um produto autólogo, com maior quantidade de fatores de crescimento e que melhora a capacidade de cicatrização de tecidos com pouco aporte sanguíneo, como tendões e articulações, diminuindo o tempo de recuperação do animal. Sabe-se que os fatores de crescimento são derivados das plaquetas, porém a correlação positiva entre o aumento na contagem plaquetária e a maior concentração de fatores de crescimento ainda é motivo de discussão entre os autores. Com o intuito de se obter um produto final com maior contagem plaquetária, é frequente o aumento da velocidade ou número de centrifugações na metodologia empregada, aumentando o risco de agregação plaquetária precoce. O objetivo do presente trabalho é estudar o efeito da dupla centrifugação no preparo de PRP, por meio da comparação entre contagens plaquetárias, concentrações de fator de crescimento TGF-β1, e grau de ativação plaquetária por meio da porcentagem de agregação. Foram utilizados 12 equinos, machos, de 3 a 5 anos, clinicamente sadios. Para tanto foram realizados dois protocolos distintos: um com centrifugação única e o outro com dupla centrifugação. No primeiro, o sangue com anticoagulante foi centrifugado a 141G/12 minutos; enquanto no segundo a primeira centrifugação foi de 300G/5 minutos seguida de 700G/15 minutos, com repouso entre as mesmas e após. Os produtos obtidos após cada centrifugação foram submetidos à contagem plaquetária, teste de agregação e quantificação de TGF--β1 por meio de kit ELISA. Os resultados obtidos demonstraram maior concentração plaquetária quando utilizado protocolo de dupla centrifugação. Agregometria evidenciou maior ativação das plaquetas durante o preparo do PRP quando submetidas a maiores velocidades de centrifugação (força gravitacional) e não ao fato das amostras serem centrifugadas duas vezes. A quantificação do TGF--β1 não mostrou diferença quando realizado em amostras com apenas uma centrifugação, mas demonstrou valores maiores no produto final da segunda centrifugação. A avaliação por meio de coeficiente de determinação e coeficiente de correlação de Pearson evidenciou correlação positiva entre contagem plaquetária e de TGF--β1. O protocolo com dupla centrifugação se mostrou mais eficaz em concentrar plaquetas e TGF--β1, não sendo prejudicado pela ativação precoce dessas plaquetas durante o preparo. / Blood derived products have been used in equine medicine with increasing frequency, being characterized as an autologous product, with greater amount of growth factors and be capable of improvement the healing capacity in tissues with poor blood supply, such as tendons and joints, reducing the time of recovery of the animal. It is known that the growth factors are derived from platelets, but the positive correlation between the increase in platelet count and the higher concentration of growth factors is still a reason for discussion among the authors. In order to obtain a final product with a higher platelet count, it is frequent to increase the speed or number of centrifugations in the methodology employed, increasing the risk of early platelet aggregation. The aim of the present study is to verify the effect of double centrifugation in PRP preparation by comparing platelet counts, TGF-β1 growth factor concentrations, and degree of platelet activation through percentage of aggregation. Twelve horses, male, aged 3 to 5 years-old, clinically healthy were subjected. Two different protocols were performed: one with single centrifugation and the other with double centrifugation. In the first one, the anticoagulated blood was centrifugated at 141G/12 minutes; while in the second one the first centrifugation was 300G/5 minutes followed by 700G/15 minutes, with rest between them and after. The products obtained after each centrifugation were submitted to platelet counting, aggregation test and measurement of TGF-β1 by ELISA kit. The results showed a higher platelet concentration when double centrifugation protocol was used. The aggregometry test evidenced a greater activation of the platelets during the preparation of PRP when submitted to higher centrifugation velocities (times g), and not to double centrifugation. Quantification of TGF-β1 showed no difference when performed on samples with only one centrifugation, but was higher values in the final product of the second centrifugation. The determination coefficient and Pearsons correlation coefficient showed a positive correlation between the platelet count and TGF-β1 concentration. The double centrifugation protocol proved to be more effective at concentrating platelets and consequently higher amounts of TGF-β1, not being impaired by early activation during obtainment.

Introdução: O sangramento por queda de escara é uma complicação potencialmente letal da ligadura elástica (LE) de varizes de esôfago. Os fatores relacionados a esse evento são pouco explorados na literatura, porém a coagulopatia, principalmente a plaquetopenia, do paciente com cirrose poderia estar implicada. O número e a função plaquetária têm particular relevância na manutenção da hemostasia, uma vez que a geração de trombina depende fortemente desses parâmetros. Entretanto, dados demonstram a preservação da função plaquetária como consequência de mecanismos compensatórios representados, principalmente, pelo aumento dos níveis do fator de von Willebrand (FVW) e diminuição de ADAMTS13. Deste modo, os pontos de corte para contagem plaquetária utilizados na prática clínica não refletiriam o risco de sangramento após procedimentos. Objetivos: O objetivo desse estudo foi descrever a função plaquetária em pacientes com cirrose e a sua influência no sangramento após LE de varizes de esôfago. Pacientes e Métodos: 1) Casuística. Foram incluídos pacientes com diagnóstico de cirrose, de diferentes etiologias, encaminhados para realização de LE como profilaxia primária ou secundária de sangramento por varizes de esôfago. Os critérios de inclusão foram: a) idade acima de 18 anos; b) pacientes com cirrose e varizes de esôfago com indicação de ligadura elástica eletiva e c) concordância em participar do estudo. Os critérios de exclusão foram: a) doenças pulmonares e cardíacas graves; b) carcinoma hepatocelular; c) insuficiência renal com uremia ou dialítica; d) uso de qualquer droga que interfere na coagulação. 2) Métodos. Imediatamente antes da realização da endoscopia digestiva com LE, foi coletada amostra de sangue de cada paciente para a realização dos seguintes testes: contagem de plaquetas, testes relacionados à função plaquetária (adesão e agregação medida pela superfície coberta (SC) com valor de referência: > 7,5% e tamanho do agregado (AS) com valor de referência: > 25um² pela tecnologia Impact- R®), antigeno de FVW (referência: 40-157%), atividade de FVW (referência: 38- 176%), proteinase ADAMTS13 (referência: 40-130%), P-selectina por citometria (34,9±2,32%) e P-selectina solúvel (92-212ng/mL). Os pacientes foram estratificados de acordo com número de plaquetas. O grau de comprometimento da função hepática foi avaliado pelos estadiamentos de Child-Pugh e MELD. O desfecho primário do estudo foi a ocorrência do sangramento atribuído à queda da escara da LE. Resultados: Foram incluídos 111 pacientes, divididos em três grupos: A) plaquetas < 50x10³/mm³ (n = 38; 34,2%); B) plaquetas entre 50x10³/mm³ e 100x10³/mm³ (n = 47; 42,4%) e C) plaquetas > 100x10³/mm³ (n = 26; 23,4%). Os três grupos não diferiram significativamente em relação aos seguintes parâmetros: gênero, etiologia e grau de disfunção hepática. Na comparação entre os grupos, os parâmetros hemoglobina e bilirrubina foram significantemente maior no grupo B (p=0,04 e p=0,009, respectivamente). Nos testes relacionados à função plaquetária, encontramos no Impact-R®, SC de 7 ± 4% e AS de 52 ± 24?m2. Na avaliação do FVW o valor encontrado foi de 369 ± 157% para o antígeno e 336 ± 149% para atividade. ADAMTS13 apresentou resultado 73 ± 24%. Na comparação entre os grupos: o parâmetro Impact-R® SC foi no grupo A: 4,9 ± 3%, no grupo B: 7,7 ± 4,6% e 9,1 ± 3,6 no grupo C (p < 0,005). O AS foi de 49,9 ± 22,4% no grupo A, no grupo B foi 55,1 ± 26,6% e 51,3 ± 20 no grupo C (p=0,599). Os outros parâmetros específicos relacionados à função plaquetária não foram significantes: o antígeno do FVW com p=0,926, a atividade do FVW com p=0,870 e ADAMTS13 com p=0,080. O resultado da P-selectina por citometria de fluxo foi de 37,8 ± 23% e P-selectina solúvel foi 182,3 ± 86 ng/mL. A maioria dos pacientes (58,5%) realizaram LE como profilaxia primária. A presença de sinais vermelhos ocorreu em 74% e a gastropatia hipertensiva foi vista em 95% dos pacientes. Houve sangramento após LE em seis (5,4%) pacientes, sendo duas ocorrências no grupo A, uma no grupo B e três no grupo C (p=0,316). O valor médio do MELD foi 13 ± 3,6, sendo 12,6 ± 3,3 no grupo sem sangramento e 16 ± 5,9 no grupo sem sangramento (p=0,025). Quando comparados os pacientes sem e com sangramento não encontramos diferença estatisticamente significante em nenhum parâmetro de função plaquetária. Conclusões: Os resultados dos testes de adesão e agregação plaquetária: SC e AS; FVW e ADAMTS13 demonstraram compensação funcional a despeito da plaquetopenia e não se correlacionaram com o risco de sangramento após LE de varizes de esôfago. O MELD foi significantemente maior nos pacientes que sangraram / Introduction: Bleeding caused by ulceration after band ligation of esophageal varices is a potentially fatal complication. Contributing factors to this event are little explored in the literature, although coagulopathy, principally thrombocytopenia, in patients with cirrhosis could be implicated. The number and function of platelets has particular relevance to the maintenance of hemostasis, since thrombin generation depends heavily on these parameters. However, data show that the preservation of platelet function is a consequence of compensatory mechanisms represented principally by an increase in von Willebrand factor (VWF) levels and a reduction in ADAMTS13. Because of this, the cutoff points for platelet count used in routine clinical practice do not reflect the risk of bleeding following invasive procedures. Objective: The aim of this study was to describe platelet function in patients with cirrhosis and its influence on the bleeding following band ligation of esophageal varices. Methodology: 1) Inclusion. Patients with cirrhosis of different etiologies, referred for band ligation as primary or secondary prophylaxis of bleeding from esophageal varices were included. Inclusion criteria were: a) age > 18 years; b) patients with cirrhosis and esophageal varices elegible for elective band ligation; c) agreement to participate in the study. The exclusion criteria were: severe pulmonary or cardiovascular disease; b) hepatocellular carcinoma; c) renal dysfunction with uremia or requiring dialysis; d) use of any medication that could interfere with coagulation. 2) Methods. Immediately prior to digestive endoscopy with band ligation, a blood sample was taken from each patient to carry out the following coagulation tests: platelet count, platelet function test (adhesion and aggregation measured as surface coverage (SC) with normal range: > 7.5% and aggregate size (AS) with normal range: > 25um² by Impact-R® technology), antigen of VWF (normal range: 40- 157%), activity of VWF (normal range: 38-176%), protease ADAMTS13 (normal range: 40-130%), P-Selectin by cytometry (34.9±2.32%) and soluble P-Selectin (92- 212ng/mL). The degree of hepatic function was staged according to Child-Pugh and MELD. The principal clinical event assessed by the study was the occurrence of post-banding bleeding. Results: 111 patients were included in the study, divided into three groups: A) platelet count < 50x10³/mm³ (n=38; 34.2%); B) platelet count between 50x10³/mm³ and 100x10³/mm³ (n=47; 42.4%); and C) platelet count > 100x10³/mm³ (n=26; 23.4%). The three groups did not differ significantly in relation to the following parameters: gender, cirrhosis etiology and degree of hepatic dysfunction. The comparison among groups showed that the parameters hemoglobin and bilirubin were significantly higher in group B (p=0.04 and p=0.009, respectively). With regards to platelet function, in Impact-R® the mean SC was 7 ± 4%; in group A was 4.9 ± 3%, in group B was 7.7 ± 4.6% and 9,1 ± 3,6 in group C (p < 0.005). The AS was 52 ± 24?m2; in group A was 49.9 ± 22.4%, in group B was 55.1 ± 26.6% and 51.3 ± 20 in group C (p=0.599). The mean VWF value was 369 ± 157% for antigen and 336 ± 149% for activity. ADAMTS13 activity values were 73 ± 24%. The comparison among groups showed that the other specific parameters for platelet function were not significant: VWF antigen with p=0.926, VWF activity with p=0.870 and ADAMTS13 with p=0.080. The result of P-Selectin by flow cytometry was 37.8 ± 23% and soluble P-Selectin was 182.3 ± 86ng/mL. The majority of patients (58.5%) underwent band ligation as primary prophylaxis. Red signs appeared in 74%, and hypertensive gastropathy was seen in 95% of patients. There was bleeding following band ligation in 6 (5.4%) of patients, with 2 occurring in group A, 1 in group B, and 3 in group C (p=0.316). The mean MELD score was 13 ± 3.6, with 12.6 ± 3.3 in the group without bleeding, and 16 ± 5.9 in the group with bleeding (p=0.025). When patients with bleeding were compared with those without, there was no statistically significant difference in any parameter for platelet function. Conclusions: The results of the platelet function test SC and AS; VWF and ADAMTS13 tests showed functional compensation for thrombocytopenia, and did not correlate with the risk of bleeding following band ligation of esophageal varices. The MELD score was significantly higher in patients who suffered bleeding

Introdução. Em pacientes com doença arterial coronária (DAC) estável, não está claro se os efeitos da redução do colesterol sobre a inflamação, agregação plaquetária e células endoteliais progenitoras (CEPs) diferem entre duas estratégias hipolipemiantes: ezetimiba associada à sinvastatina em dose moderada e sinvastatina isolada em dose elevada. Objetivo. Avaliar os efeitos de sinvastatina em dose elevada comparada a ezetimiba associado à sinvastatina em dose moderada sobre a inflamação, agregação plaquetária e CEPs. Métodos e Resultados. Pacientes com DAC estável (n=83, 63 ± 9 anos, 48 homens), em uso de sinvastatina 20 mg, foram randomizados para tratamento com sinvastatina 80 mg (S80) ou ezetimiba 10 mg/sinvastatina 20 mg (E10/S20), por seis semanas. O perfil metabólico e lipídico, a proteína C-reativa (PCR), molécula de adesão intercelular solúvel (sICAM)-1, proteína quimiotática de monócitos (MCP)-1, interleucinas (IL) -1, -6 e -10, glicoproteína CD-40 ligante solúvel (sCD-40L), LDL oxidado (LDLox), células endoteliais progenitoras (CEPs) e a agregação plaquetária pelo platelet function analyzer (PFA)-100 foram avaliados antes e após o tratamento. Os níveis basais de lipídios, marcadores inflamatórios, CEPs e PFA-100 foram similares em ambos os grupos. Após o tratamento com S80 e E10/S20, ambos os grupos apresentaram: (1) Redução significante e similar de LDL-C (-23 + 30% vs -29 + 13%, respectivamente; p=0,46), Apo-B (-22 + 15% vs -18 + 17%, respectivamente; p=0,22) e LDLox (-18 + 47% vs -15 + 33%, respectivamente; p=0,65); (2) Redução modesta, similar e não significativa de PCR (-16% [IIQ: -42 - 7] vs -11% [IIQ= -37 26], respectivamente; p= 0,3). Nenhuma alteração significante foi encontrada nos marcadores inflamatórios restantes ou nas CEPs. (3) O PFA-100 elevou-se significativamente com E10/S20, mas não com S80 (27 + 43% vs 8 + 33%, respectivamente; p=0,02). Conclusão. Nossos dados demonstram que em pacientes com DAC estável: (1) Tanto S80 como E10/S20 são igualmente eficientes na redução de LDL-C e apresentam efeitos anti-inflamatórios semelhantes; (2) E10/S20 apresentou efeito antiagregante plaquetário mais eficiente do que S80. Portanto, apesar de apresentarem efeitos hipolipemiantes e anti-inflamatórios semelhantes, E10/S20 promoveu maior efeito pleiotrópico antiagregante plaquetário do que S80, a despeito da dose quatro vezes menor de estatina na combinação. Novos estudos são necessários para elucidar os efeitos antiplaquetários da ezetimiba / Background. Among patients with stable coronary artery disease (CAD), it is not clear if the effects of cholesterol reduction on inflammation, platelet aggregation and endothelial progenitor cells (EPCs) differ between combined ezetimibe plus moderate-dose simvastatin and high-dose simvastatin alone. Objective. We sought to test the effects of a higher simvastatin dosage compared with combined treatment with ezetimibe plus a moderate simvastatin dose, on inflammation, platelet aggregation and EPCs. Methods and Results. CAD patients (n=83, 63 ± 9 years, 48 men), on simvastatin 20 mg, were randomly allocated to receive the combination ezetimibe 10 mg/simvastatin 20 mg (E10/S20) or simvastatin 80 mg (S80), for 6 weeks. Lipid profile, inflammatory markers (C-reactive protein [CRP], interleukin -1, -6 and -10, monocyte chemotactic protein (MCP)-1, soluble intercellular adhesion molecule (sICAM)-1, soluble CD-40 ligand [sCD-40L] and oxidized LDL [oxLDL]), platelet aggregation (platelet function analyzer [PFA]-100) and EPCs were determined before and after treatment. Baseline lipids, inflammatory markers and PFA-100 were similar in both groups. After treatment, S80 and E10/S20 patients presented: (1) significant and similar reductions on LDL-C (-23 + 30% vs -29 + 13%, respectively; p=0.46), Apo-B (-22 + 15% vs -18 + 17%, respectively; p=0.22) and oxLDL (-18 + 47% vs -15 + 33%, respectively; p=0.65), and (2) modest lowering on CRP (-16% [IIQ: - 42 - 7] vs -11% [IIQ= -37 26], respectively; p= 0.3). No significant changes were denoted among other inflammatory markers or EPCs. (3) PFA-100 increased significantly with E10/S20 but not with S80 (27 + 43% vs 8 + 33%, p=0.02). Conclusions. These data show that among stable CAD patients: (1) both E10/S20 and S80 are equally effective in reducing LDL-C, and have similar anti-inflammatory effects. (2) E10/S20 is more effective than S80 in inhibiting platelet aggregation. Thus, despite similar lipid lowering and antiinflammatory effects, and a dose four times less of simvastatin, E10/S20 induced a greater pleiotropic platelet inhibition than S80. The potentially favorable antiplatelet effects of E10/S20 merit further study