Orientador : Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:16:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcondes_Sisi_M.pdf: 1350122 bytes, checksum: f4aa256f4d95f590a00d37a6de099465 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: O objetivo desta tese foi caracterizar farmacologicamente a ativação plaquetária induzida pela polilisina (poliaminoácido básico) em plasma rico em plaquetas ou plaquetas lavadas humanas e verificar a influência dos sítios aniònicos na ativação plaquetária induzida por este policátion. A agregação plaquetária foi monitorada utilizando-se um agregômetro Payton ou Chrono-Log e a liberação de TXA2 foi medida através de seu produto de degradação TXB2 por radioimunoensaio. O perfil do sulfato de condroitina em plaquetas foi analisado através de eletroforese em gel de agarose. Em PRP polilisina induziu agregação dependente da concentração e do peso molecular do policátion. Esta agregação foi acompanhada pela liberação de TXA2 e inibida por nitroprussiato de sódio e iloprost. Antagonistas de receptores de plaquetas para ADP, adrenalina, PAF e colágeno não modificaram a agregação induzida por polilisina em PRP. Em PL o efeito de polilisina também foi dependente do peso molecular do policátion. Este efeito não foi inibido por EDTA, iloprost e apenas parcialmente por SNP e não foi acompanhado por liberação de TXA2. Poliânions como o ácido poliglutâmico inibiram o efeito de polilisina quando adicionado antes ou depois deste evento. A agregação de polilisina em PRP ou o efeito deste policátion em PL não foram modificados por heparinase, heparitinase I ou heparitinase II, contrariamente, a condroitinase inibiu de maneira dose-dependente a agregação em PRP, mas não modificou o efeito deste poliaminoácido básico em PL. Nossos resultados demonstraram que a polilisina induz agregação em PRP, mas não em plaquetas lavadas. A agregação induzida pela polilisina em PRP deve-se a carga catiônica do policátion e depende parcialmente da presença de sulfato de condroitina na membrana plaquetária. Em plaquetas lavadas, a aglutinação induzida pela polilisina não se deve à interação com sulfato de condroitina. Estes resultados levam a hipótese que o sulfato de condroitina apresenta características de receptor plaquetário, visto que a interação eletrostática com um policátion, como a polilisina, leva a um fenômeno de ativação metabólica. A expressão de sítios aniônicos das plaquetas pode desta maneira modular sua reatividade aos diversos agonistas / Abstract: The aim of this thesis was to pharmacologically characterize the platelet aggregation induced by polylysine, a polyamino acid, in human platelet-rich plasma (PRP) and in washed platelets (WP) and to examine the importance of cell membrane anionic sites in mediating the responses to this polycation. Platelet aggregation was monitored using a two-channel Payton or a one- channel Chrono-Log aggregometer. The release of TXA2 by stimulated platelets was quantified by measuring the levels of its degradation product TXB2 using an appropriate radioimmunoassay. The platelet membrane chondroitin sulfate profile was determined by agarose gel electrophoresis. In PRP, polylysine induced a concentration- and molecular weight- dependent aggregation which was accompanied by the release of TXA2 and was inhibited by sodium nitroprusside {SNP) and iloprost. Antagonists to platelet receptors for ADP, adrenaline, collagen and platelet activating factor (PAF) had no influence on the aggregation induced by polylysine. In WP, the aggregation induced by polylysine was also dependent on the polycation molecular weight. This response was not inhibited by EDTA or iloprost but was partially inhibited by SNP. There was no accompanying formation of TXA2. Polyanions such as polyglutamic acid inhibited or reversed the action of polylysine when added before or after the polycation, respectively. Neither the aggregation induced by polylysine in PRP nor the response induced in WP was modified by preincubation of the platelets with heparinase, heparitinase I or heparitinase II. In contrast, chondroitinase dose-dependently inhibited the aggregation in PRP but had no effect on the response in WP. These results suggest that polylysine induces aggregation in PRP but not in WP. The aggregation in PRP is due to the cationic charge of the polycation and depends, at least in part, on the presence of chondroitin sulfate in the platelet membrane. In WP, the agglutination induced by polylysine does not involve an interaction with chondroitin sulfate. These observations indicate that chondroitin sulfate may function as a type of platelet membrane receptor since the electrostatic interaction of a polycation such as polylysine can lead to metabolic activation of these cells. The expression of anionic sites on the surface of the platelet membrane could therefore be a means by which the platelet regulates its responsiveness to a variety of agonists / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-15Bitstream added on 2014-12-02T11:21:21Z : No. of bitstreams: 1 000796005_20151215.pdf: 884634 bytes, checksum: bc4f6785760138af338c166ddc717652 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-15T10:52:44Z: 000796005_20151215.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-15T10:53:23Z : No. of bitstreams: 1 000796005.pdf: 1773757 bytes, checksum: bb24f59f94a0486d6bee4cf211bccd36 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A terapia gênica baseada em vetores não virais, tais como aqueles que se utiliza de sistemas poliméricos, é uma proposta promissora para o tratamento de doenças que se manifestam devido alguma disfunção gênica. Entretanto, o maior desafio desta técnica é a transferência do material genético, e a maioria dos esforços focaliza o desenvolvimento de vetores eficientes que possam transportar e transferir o DNA de modo seguro e eficaz. Neste trabalho, buscou-se sintetizar derivados de Poli(L-Lisina) (PLL) introduzindo o grupo fosforilcolina (PC) nos grupos amino da PLL, procurando-se variar os graus de substituição, com o objetivo de melhorar as propriedades deste vetor. A caracterização dos derivados foi realizada por RMN de hidrogênio, FTIR-ATR e GPC. O grau de substituição foi determinado com as técnicas de RMN de hidrogênio e potenciometria. A modificação da PLL com PC aumentou a capacidade de tamponamento dos derivados substituídos, o que pode melhorar a eficiência de transfecção. Estudos de interação entre PLL e PLL-PC com o DNA plasmidial VR1412 foram realizados em dois pHs (pH 5,0 e 7,4) por meio das técnicas de espectroscopia de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta. Os resultados mostraram que os derivados são capazes de formar poliplexos e que a interação depende do grau de substituição, do pH, e da razão de cargas (razão N/P: razão de mol de grupos amino (polímero) por mol de grupos fosfato (pDNA)). Os estudos de espalhamento de luz dinâmico mostraram a formação de nanopartículas com diâmetros de 150 a 300 nm em pH 5,0 e de 350 a 700 nm em pH 7,4. As partículas exibiram carga superficial positiva (~ +25 mV em pH 5,0 e ~ +10 mV em pH 7,4), propriedade importante no processo de internalização dos poliplexos por endocitose. A viabilidade celular utilizando o ensaio colorimétrico com o MTS mostrou que proporções crescentes de PC podem ... / Gene therapy based on non-viral vectors, such as those that utilize polymerics systems, is a promising treatment for diseases that arise due some genetic disorder. However the challenge of using this technique is the transfer of the genetic material and most of the efforts have focused on the development of effective vectors to efficiently deliver the DNA into the cells. In this work, the main purpose was to synthesize PLL derivatives containing increasing proportions of the group phosphorylcholine (PC), aiming to improve the PLL properties as a non viral vector. The derivatives were characterized by ¹H NMR, FTIR-ATR and GPC techniques. The degree of substitution was determined by ¹H NMR and potentiometry. The buffering capacity was evaluated and showed the grafting with PC groups increased the buffering capacity, which may improve the transfection efficiency. The interaction between PLL and PLL-PC derivatives and the plasmid VR 1412, was studied at two pH values (pH 5.0 and 7.4) by fluorescence, agarose gel electrophoresis, dynamic light scattering and zeta potential techniques. The results showed that all derivatives were able to form polyplexes depending on the degree of substitution, pH and the charge ratio (N/P, the ratio of amino groups to phosphate groups from the pDNA). Nanoparticles prepared using the coacervation process showed sizes varying from 150 to 300 nm at pH 5.0 and from 350 to 700 nm at pH 7.4. The particles exhibited positives surface charges (~ +25 mV at pH 5.0 and ~ +10 mV at pH 7.4) an important property for promoting the internalization process by endocytosis. Cell viability using the MTS colorimetric assay showed that increasing proportions of PC groups can reduce the cytotoxicity of nanoparticles, and IC50 values for the sinthesized polymers were graphically determined. The in vitro transfection efficiencies were shown to depend on the degree of substitution and N/P ratio and all the derivatives showed ...

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Miguel Jafelicci Junior / Banca: Julio C. Fernandes / Resumo: A terapia gênica baseada em vetores não virais, tais como aqueles que se utiliza de sistemas poliméricos, é uma proposta promissora para o tratamento de doenças que se manifestam devido alguma disfunção gênica. Entretanto, o maior desafio desta técnica é a transferência do material genético, e a maioria dos esforços focaliza o desenvolvimento de vetores eficientes que possam transportar e transferir o DNA de modo seguro e eficaz. Neste trabalho, buscou-se sintetizar derivados de Poli(L-Lisina) (PLL) introduzindo o grupo fosforilcolina (PC) nos grupos amino da PLL, procurando-se variar os graus de substituição, com o objetivo de melhorar as propriedades deste vetor. A caracterização dos derivados foi realizada por RMN de hidrogênio, FTIR-ATR e GPC. O grau de substituição foi determinado com as técnicas de RMN de hidrogênio e potenciometria. A modificação da PLL com PC aumentou a capacidade de tamponamento dos derivados substituídos, o que pode melhorar a eficiência de transfecção. Estudos de interação entre PLL e PLL-PC com o DNA plasmidial VR1412 foram realizados em dois pHs (pH 5,0 e 7,4) por meio das técnicas de espectroscopia de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta. Os resultados mostraram que os derivados são capazes de formar poliplexos e que a interação depende do grau de substituição, do pH, e da razão de cargas (razão N/P: razão de mol de grupos amino (polímero) por mol de grupos fosfato (pDNA)). Os estudos de espalhamento de luz dinâmico mostraram a formação de nanopartículas com diâmetros de 150 a 300 nm em pH 5,0 e de 350 a 700 nm em pH 7,4. As partículas exibiram carga superficial positiva (~ +25 mV em pH 5,0 e ~ +10 mV em pH 7,4), propriedade importante no processo de internalização dos poliplexos por endocitose. A viabilidade celular utilizando o ensaio colorimétrico com o MTS mostrou que proporções crescentes de PC podem ... / Abstract: Gene therapy based on non-viral vectors, such as those that utilize polymerics systems, is a promising treatment for diseases that arise due some genetic disorder. However the challenge of using this technique is the transfer of the genetic material and most of the efforts have focused on the development of effective vectors to efficiently deliver the DNA into the cells. In this work, the main purpose was to synthesize PLL derivatives containing increasing proportions of the group phosphorylcholine (PC), aiming to improve the PLL properties as a non viral vector. The derivatives were characterized by ¹H NMR, FTIR-ATR and GPC techniques. The degree of substitution was determined by ¹H NMR and potentiometry. The buffering capacity was evaluated and showed the grafting with PC groups increased the buffering capacity, which may improve the transfection efficiency. The interaction between PLL and PLL-PC derivatives and the plasmid VR 1412, was studied at two pH values (pH 5.0 and 7.4) by fluorescence, agarose gel electrophoresis, dynamic light scattering and zeta potential techniques. The results showed that all derivatives were able to form polyplexes depending on the degree of substitution, pH and the charge ratio (N/P, the ratio of amino groups to phosphate groups from the pDNA). Nanoparticles prepared using the coacervation process showed sizes varying from 150 to 300 nm at pH 5.0 and from 350 to 700 nm at pH 7.4. The particles exhibited positives surface charges (~ +25 mV at pH 5.0 and ~ +10 mV at pH 7.4) an important property for promoting the internalization process by endocytosis. Cell viability using the MTS colorimetric assay showed that increasing proportions of PC groups can reduce the cytotoxicity of nanoparticles, and IC50 values for the sinthesized polymers were graphically determined. The in vitro transfection efficiencies were shown to depend on the degree of substitution and N/P ratio and all the derivatives showed ... / Mestre

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T11:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bresolin_IgorTadeuLazzarotto_D.pdf: 3279874 bytes, checksum: b2f9ab93ce7e5036f95f0da584a42017 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Dentre os hemoderivados disponíveis comercialmente, as imunoglobulina do isotipo G (IgG) recebem destaque pelo seu uso em aplicações terapêuticas. Por esta razão são requeridas com elevado grau de pureza. Várias técnicas vêm sendo investigadas para a purificação de IgG a partir do soro ou plasma humano, desde a precipitação até métodos mais seletivos, como os cromatográficos. Neste trabalho, investigou-se o efeito de agentes quelantes de IMAC (cromatografia por íons metálicos imobilizados) como Tris-2(aminoetil)amina (TREN) e o-fosfoserin (OPS) como grupos ionogênicos (sem íon metálico imobilizado), além do aminoácido L-Lisina e seu polímero poli-L-Lisina (PLL) como ligantes visando a purificação de IgG a partir do soro humano. Para tanto, foram realizados experimentos de adsorção em diferentes sistemas tamponantes. A seletividade dos adsorventes foi verificada por eletroforese SDS-PAGE e análise nefelométrica. As melhores condições, para cada caso, foram utilizadas em experimentos de curvas de ruptura e isotermas de adsorção de albumina de soro humano (HSA) e IgG. No caso dos ligantes TREN e PLL, 73% e 86% da IgG alimentada foi recuperada nas frações não-retidas (cromatografia negativa) apresentado pureza superior a 90%. Quando o ligante OPS foi utilizado, por sua vez, a recuperação de IgG ocorreu nas frações retidas juntamente com IgM. Experimentos de curva de ruptura mostraram que um fator de purificação de 4.9 foi atingido, sendo a IgG recuperada com pureza de 88%. Este ligante se mostrou eficiente quando se deseja purificar IgG humana que possui pontos isoelétricos na faixa de 7,8 a 8,5. Para todos os ligantes, a recuperação de IgG a partir soro humano pode ser alcançado sob condições brandas de pH, baixa força iônica, e temperatura ambiente. De um ponto de vista de processo em larga escala, todos os ligantes apresentados neste trabalho apresentam potencial para serem usados como uma das etapas em um processo industrial de recuperação e purificação de IgG / Abstract: Among the commercially available hemoderivatives or blood products, the immunoglobulin G (IgG) is highlighted by its use in therapeutic applications, which need high purity IgG. Several techniques are being investigated aiming at the purification of IgG from human serum or plasma, usually starting with precipitation and then using more selective methods such as chromatography. In this study, we evaluated the effect of Tris-2 (aminoethyl) amine (TREN) and o-phosphoserine (OPS) - two chelating agents used in immobilized metal ion chromatography (IMAC) - as ionogenic groups (without immobilized metal ion), and the amino acid L-lysine and its polymer poly-L-lysine (PLL) as ligands aiming at the purification of IgG from human serum. For this purpose, adsorption experiments were performed using different buffering systems. The selectivity of the adsorbents was checked by SDS-PAGE and nephelometric analysis. The best conditions for each adsorbent were used in experiments of breakthrough curves and adsorption isotherms of human serum albumin (HSA) and IgG. In the case of TREN and PLL, 73% and 86% of IgG fed was recovered in the non-retained fractions (negative chromatography) with purity higher than 90%. When the ligand OPS was used, IgG was recovered in retained fractions. Experiments of breakthrough curve showed that a purification factor of 4.9 was reached, and IgG was recovered with a purity degree 88% (with IgM). This ligand is efficient when it is desired to purify human IgG with isoelectric points ranging from 7.8 to 8.5. For all ligands, the recovery of IgG from human serum was achieved under mild conditions of pH, low ionic strength and temperature. All ligands presented in this study have potential to be used in an industrial downstream processing of IgG from human serum / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química