Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T21:02:22Z : No. of bitstreams: 1 garcia_fai_dr_jabo.pdf: 798787 bytes, checksum: cc4872fa6b42f7f6ec29fb841ea304bd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs.

Orientador : Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T02:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_RomiLamb_M.pdf: 3093253 bytes, checksum: 4f20326cbb9b0af4dab6d00f6bd2178e (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A contaminação por endotoxinas (ET) em produtos para injeção parenteral é um problema para a indústria farmacéutica devido à dificuldade de remoção destas moléculas e sua alta toxicidade. Diversas técnicas têm sido estudadas visando a despirogenação (remoção de ET) de soluções protéicas, dentre as quais a cromatografia em membranas apresenta-se como promissora. Neste trabalho, membranas porosas de quito sana reticuladas com epic1oridrina foram obtidas com boa característica de vazão, visando a despirogenação de soluções tampão, de soro fisiológico e de soluções de IgG. Experimentos de filtração com solução de IgG humana diluída em tampão foram realizados para verificar a existência de adsorção da IgG na membrana, sendo que as soluções tamponantes que favoreceram uma menor adsorção foram fosfato de sódio pH 8,0 e Tris-HCl pH 7,0 (0,49 mg/cm3 e 0,73 mg/cm3, respectivamente). Os resultados dos experimentos de adsorção com soluções tampão contaminadas artificialmente com ET revelaram que a solução tamponante Tris-HCl pH 7,0 favorecia uma maior adsorção de ET na membrana de quito sana, obtendo valores de concentração no filtrado de 0,58 EU/mL e 8,36 EU/mL para alimentações, respectivamente, de 18,63 EU/mL e 541,40 EU/mL. Testou-se a influência da presença de sal no meio através da remoção de ET de soro fisiológico contaminado artificialmente, resultando em uma adsorção, das ET alimentadas à membrana, de 50,68% em baixa concentração de ET (42,49 EU/mL) e de 92,23% em alta concentração (889,61 EU/mL). A presença de IgG (1 mg/roL) em solução tampão Trís-HCl pH 7,0 reduziu a adsorção das endotoxinas permitindo obter filtrados com concentração de 4,05 e 71,15 EU/mL de uma alimentação de 116,43 e 796,93 EU/mL, respectivamente, e recuperação protéica, na ordem, de 100 e 96,37%. Em face destes dados, percebe-se que a membrana de quito sana tem potencial para o uso como matriz de adsorção visando a remoção de ET de soluções, embora na presença de proteína, no processo proposto, não se tenha alcançado valores que permitam uma injeção parenteral / Abstract: Endotoxin (ET) contamination in intravascular injection products is a problem for the pharmaceutical industry due to the difficulty of its removal and elevated toxicity. Many techniques have been studied aiming the depyrogenation (ET removal) of protein solutions, among them the membrane chromatography seems to be a promising one. In this work, cross-linked macroporous chitosan membranes were obtained having a good flow dynamics, focusing the depyrogenation of buffering solutions, physiologic serum and human IgG solutions. Filtration experiments with human IgG diluted in buffering solution were conducted to verify the IgG adsorption on the membrane. The buffering solutions that resulted a lower IgG adsorption were sodium phosphate pH 8.0 and Tris-HCl pH 7.0 (0.49 mg/cm3 and 0.73 mg/cm3 , respectively). The adsorption experiments results using buffer solutions artificially contaminated with ET showed that the Tris-HCl pH 7.0 buffering solution favoured a higher ET adsorption on the chitosan membrane being the filtrated concentrations 0.58 EU/mL and 8.36 EU/mL to the feed flow of 18.63 EU/mL and 541.4 EU/mL, respectively. The influence of salt presence in the solution was tested for the ET removal of artificially contaminated physiologic serum resulting in a 50.68% adsorption at a low ET concentration (42.49 EU/mL) and 92.23% at a high ET concentration (889.61 EU/mL). The IgG presence (1 mg/mL) in Tris-HCl pH 7.0 buffer reduced the ET adsorption so that a filtrated concentration of 4.05 and 71.15 EU/mL were obtained from a 116.43 and 796.93 EU/mL feed, respectively, and a protein recovery of 100% and 96.37%. These results showed that chitosan membrane has a potential to be used as an adsorption matrix for ET removal in solutions, eventhought safety concentration values that allows a parenteral injection have not been achieved in samples containing proteins / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Iracema de Mattos Paranhos Calderon / Coorientador: Adenilda Cristina Honório França / Banca: Yuri Karen Sinzato / Banca: Debora Cristina Damasceno Meirelles dos Santos / Banca: Mahmi Fujimori / Banca: Mara Sandra Hoshida / Resumo: Durante a gravidez, a hiperglicemia materna altera a expressão e a transferência de células imunorregulatórias e de imunoglobulinas e o perfil de citocinas na interface materno-fetal. Avaliar, em gestações complicadas por hiperglicemia, a expressão de células NK e o perfil de citocinas no sangue, materno e do cordão umbilical, e na placenta (artigo 1); quantificar a produção de anticorpos e a passagem de IgG total, e respectivas subclasses, via receptor FcRn (artigo 2). MÉTODO - Foram avaliadas 120 gestantes, distribuídas nos grupos: não-diabético (ND; N = 30), hiperglicemia gestacional leve (HGL; N = 30), diabetes mellitus gestacional (DMG; N = 30) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2; N = 30). Técnicas de citometria de fluxo foram utilizadas para análise de células e citocinas e, de ELISA, para avaliação das concentrações de IgG total e subclasses. A transferência placentária de anticorpos totais, e respectivas subclasses, foi definida pela relação [(concentrações no sangue de cordão umbilical/sangue materno) x 100]. Na análise estatística foram realizadas análises de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey, e de correlação de Pearson, com p < 0,05. No sangue materno dos grupos hiperglicêmicos, as células NK CD16+CD56- aumentaram, enquanto que CD16+CD56+ foi menor no grupo DMG. No sangue do cordão do grupo DM2 mostrou uma maior proporção de células CD16+CD56- e CD16-CD56+. As camadas extravilosas da placenta dos grupos DMG e DM2 most... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: - During pregnancy, the immune response associated with diabetes alters the expression and the transfer of immune cells, including regulatory, immunoglobulins and the profile of cytokines in the maternal-fetal interface. To evaluate the expression of NK cells, and the profile of cytokines in maternal blood, umbilical cord and placenta, quantify the production of antibodies, as well as, the passage of IgG and subclasses, via receptors FcRn in pregnancies complicated by diabetes or hyperglycemia.Wereessed 120 pregnant women, distributed as non-diabetic (ND; n=30), Mild Gestational Hyperglycemia (MGH; n=30), Gestational Diabetes Mellitus (GDM; n=30) and type 2 Diabetes Mellitus (DM2; N=30). The cells and cytokines were evaluated by flow cytometry. The concentrations of total IgG and subclasses were analyzed by ELISA. Placental transfer of the total and subclasses antibodies were defined in each assay by the ratio [(cord concentrations/maternal concentrations) x 100]. In the statistical analysis we used analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey test, and Pearson's linear correlation, with p < 0.05. RESULTS - In the maternal blood from the hyperglycemic groups, the CD16+CD56− NK cells increased, whereas that of CD16+CD56+ decreased in GDM group. Cord blood from DM2 showed a higher proportion of CD16+CD56− and CD16−CD56+. The placental extravillous layer of GDM and DM2 showed an increase of CD16+CD56− cells and, irrespective of region, the proportion of CD16−CD56+ cells was higher in MGH and GDM and lower in DM2. IL-2 was lower in maternal blood and IFN-���� higher in maternal and cord blood from the GDM group. IL-17 was higher in maternal and cord blood from the DM-2 group. The placental extravillous layer of the MGH showed high levels of IL-4, IL-6, IL-10, IL- 17, and IFN-���� and low levels of IL-1���� and IL-8, whereas the placental villous layer... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientadora: Mary Marcondes / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Áureo Evangelista Santana / Banca: Vera Lúcia Fonseca de Camargo-Neves / Banca: Carlos Eduardo Larsson / Resumo: O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / Abstract: The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs. / Doutor

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:57:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thais_souza_ioc_mest_2014.pdf: 1397984 bytes, checksum: 4efc283bdf7ad7d0f355a158852d5702 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Introdução: A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial e acomete animais das mais variadas espécies, inclusive o homem. Os casos de toxoplasmose em seres humanos e animais frequentemente não são relatados. Isto pode se dá pelo fato da infecção caracterizar-se por ser assintomática em 90% dos casos humanos e quando sintomáticas estes não apresentam sintomas patognomônicos. Desta maneira, existem dificuldades na caracterização clínica desta patologia sendo necessária a confirmação laboratorial e posterior notificação. Sendo assim, este estudo teve como objetivo verificar a soroprevalência da infecção por Toxoplasma gondii numa população do Município de Angra dos Reis, no Estado do Rio de Janeiro. O estudo teve início a partir de uma demanda da Secretaria Municipal de Saúde de Angra dos Reis \2013 Núcleo de Vigilância Epidemiológica, que no primeiro trimestre de 2012 havia identificado a presença de 22 casos de Toxoplasmose em um dos cinco distritos sanitários do município. Material e Métodos: Anticorpos IgM e IgG anti-Toxoplasma gondii foram pesquisados, por meio da RIFI e ELISA, em 384 indivíduos residentes do 3º distrito onde havia ocorrido a maioria dos casos. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do IOC/Fiocruz. Após serem esclarecidos sobre o projeto e assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, os participantes da pesquisa responderam a um questionário epidemiológico e em seguida foram coletadas amostras de sangue dos mesmos para a sorologia Todos os participantes foram avaliados por um médico infectologista. Resultados: Na comparação dos resultados obtidos pelos testes ELISA e RIFI, obteve-se um Kappa para IgG de 48,9%, o que indicava concordância regular. Desde modo optou-se por utilizar os resultados de ELISA por ser o mais utilizado nos laboratórios de análise clínica. Das 384 amostras analisadas por meio do ELISA, observou-se uma frequencia de 69,0% de sororreagentes na região. Destes, 22 (5,72%) foram IgM reagentes em ELISA e todos foram IgM não reagentes na RIFI. Destes 22, 7 (31,82%) apresentavam clínica sugestiva de toxoplasmose no momento da primeira coleta. Enquanto para IgG foi verificado 265 (69,0%) reagentes. O teste de Avidez de IgG, foi realizado em sete (31,82%) amostras IgM reagentes, sendo encontrada alta avidez de IgG em duas (28,57%) amostras, avidez intermediária em duas (28,57%) e baixa avidez em três (42,86%). Pela análise das respostas dos indivíduos entrevistados, não foram verificadas diferenças significativas entre as variáveis faixa etária, nível de escolaridade, conhecimento da infecção, consumo de água não tratada, hábitos e comportamentos alimentares, como ingestão de leite cru, ingestão de carne crua ou mal cozidas, embutidos crus e vegetais crus, contato com gatos, destino do lixo Foi observado significância estatística no que se refere a presença de roedores na residência, demostrando a possibilidade de ingestão de oocistos carreados por esses. Discussão/Conclusão: Foram identificados pelo menos 3 casos de toxoplasmose adquirida na fase aguda e recente da infecção, sendo que um deles não apresentava sintomatologia sugestiva da doença. Suscitando a necessidade de outros estudos do meio ambiente e dos animais da mesma região / Toxoplasmosis is a zoonosis of worldwide distribution, affecting animals of different species, including man. Human and animals cases of toxoplasmosis are often not reported. This happens because the infection is asymptomatic in almost 90% of the human cases and when it is symptomatic there are no presence of pathognomonic symptoms. Thus, there are difficulties in the clinical characterization of this pathology, laboratory confirmation and further notification is required. Therefore, this study aimed to determine the seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in a population from Angra dos Reis municipality in the state of Rio de Janeiro. The study begins following a request made by the Municipal Health Secretary of Angra dos Reis - Center for Epidemiological Surveillance, in the first quarter of 2012, when they identified the presence of 22 cases of toxoplasmosis in one of five health districts in the county. IgM and IgG anti-Toxoplasma gondii were investigated by means of IFAT and ELISA in 384 individuals living in the 3rd district which most of the cases had occurred. The project was approved by the Ethics Committee. After being informed about the project and signed an informed consent, survey participants answered an epidemiological questionnaire and then blood samples were collected. All participants were evaluated by an infectious disease physician. Comparing the results obtained by ELISA and IFA tests, a Kappa for IgG of 48.9% was obtained, which indicated fair agreement between them. So we agree to use the results of ELISA, because this is the most common used test in clinical analysis laboratories. Of the 384 samples tested, we found a frequency of 72.39% seropositive individuals in the study region. 22 (5.72%) were IgM ELISA reagents and all were IgM non-reactive by IFAT. From these individuals, 22, 7 (31.82%) had suggestive symptoms of toxoplasmosis at the time of the first collection. While,IgG was found in 265 (69.0%) participants. The IgG avidity test was performed in ten (45.45%) IgM reactive samples, high IgG avidity was found in three (30%) of them, intermediate avidity in four (40%) and low avidity in three (30 %). Analyzing the responses of the questionnaire, no significant differences between the variables age, level of education, knowledge of infection, consumption of untreated water, eating habits and behaviors such as drinking raw milk, eating raw or undercooked meat cooked, raw sausages and raw vegetables, contact with cats and garbage disposal were verified. Statistical significance was observed with regard to the presence of the rodents in the residence, demonstrating the possibility of ingestion of oocysts. We identified at least three cases of acquired toxoplasmosis in acute and recent phase of infection, one of whom had no symptoms suggesting disease, indicating the need for further studies involving animals and their environment, in the same region. / 2100-04-26

Orientadores: Sonia Maria Alves Bueno, Paulo de Tarso Vieira e Rosa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-26T21:37:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aquino_LucianaCristinaLinsde_M.pdf: 5114792 bytes, checksum: e7d2de55259ac53d6cb7ff9c538344a9 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A técnica de adsorção por afinidade, que utiliza adsorventes com alta seletividade para adsorver compostos, principalmente proteínas, tem sido empregada para remover autoanticorpos do plasma de pacientes com doenças auto-imunes e também na produção em larga escala de drogas terapêuticas através do ftacionamento do plasma humano ou animal. Na circulação extracorpórea o plasma do paciente é alimentado em uma coluna contendo um ligante imobilizado em uma matriz insolúvel que remove os auto-anticorpos, e as proteínas não adsorvidas retomam para o paciente sem nenhuma alteração. Na busca de sistemas adequados para a aplicação no tratamento de doenças auto-imunes, esta pesquisa investiga a adsorção de IgG em dois suportes de afinidade empregando a histidina como ligante, imobilizado em membranas de fibras ocas de álcool poli etileno vinílico (pEV A) e gel de copolímero de metacrilato (Toyopearl), denominados His-PEV A e His- Toyopearl, respectivamente. Sendo verificada a possibilidade de adsorção de IgG em ambos suportes, experimentos de seletividade e de capacidade de adsorção em modo dinâmico e estático demonstraram uma maior eficiência para o sistema His-PEV A do que para o HisToyopearl, tanto na presença do tampão Hepes a pH 7,0 como do Tris-HCI pH a 7,4. Através da obtenção de isotermas de adsorção, para os suportes com e sem ligante, à temperatura ambiente e à 37 °C, foi constatada a existência de interações não-específicas entre a proteína e a matriz, sendo necessário efetuar as etapas de lavagem, eluição e regeneração, após ser atingido o equilíbrio de adsorção, para obter a quantidade de proteína adsorvida especificamente nos suportes. A determinação de parâmetros como a capacidade máxima de adsorção, a constante de dissociação do complexo IgG-histidina (KJ) e as constantes cinéticas de adsorção (Iça) de dessorção (kd) de proteína, indicaram que apesar de ambos sistemas apresentarem uma afinidade pela proteína da mesma ordem de grandeza (lO-sM), o suporte His-PEV A apresenta uma maior capacidade para a adsorção específica de proteína, nas temperaturas analisadas / Abstract: Affinity adsorption explores the characteristics that certain compounds have to selectively interact with substances or classes of substances. This technique has been used to purify proteins in small and large scale and also to remove autoantibodies from plasma of autoimmune patients. In an extracorporeal treatment, the autoantibodies are retained in a column that contains an affinity ligand immobilized in an insoluble matrix. The unretained fraction containing the plasma proteins different from the autoantibodies can be returned to the patient. In this work, the behavior of IgG adsorption either onto poly ethylene vinyl alcohol (pEV A) hollow-fiber membranes or onto metacrylate gels (Toyopearl) containing histidine as affinity ligand was studied. The IgG adsorption in both supports was feasable. The selectivity studies as well as the static and dynamic adsorption experiments showed that the IgG adsorption onto PEV A hollow-fibers was more efficient than onto Toyopearl, independently ifHepes pH 7.0 or Tris-HCI 7.4 buffer were used. The adsorption isotherms of IgG in the supports with or without ligand showed that there is also non-specific adsorption of the protein onto the matrix surface. The amount of specifically adsorbed protein was determined by the elution and regeneration of the support following extensive washing of the particles with buffer. The values of the adsorption capacity constant (Qm), dissociation constant of the IgG-histidine complex (Kd), adsorption constant (ka), and desorption constant (kd) indicated that both systems have approximately the same affinity for the IgG (10.5 M) and that PEV A hollow-fibers have a large specific adsorption capacity. This behavior was observed for temperatures of25 and 37°C / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-12T21:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_MariaCristianeMartinsde_M.pdf: 4631873 bytes, checksum: 3ea11569f1a6cd0e7b608b162b33068a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As imunoglobulinas (em particular, Imunoglobulina G (IgG)) têm uma aplicação ampla, sendo essenciais em testes de diagnóstico in vitro, em terapia, análises e investigação em diversas áreas. Muitos estudos têm sido realizados visando à purificação de IgG, destacando-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, negativa e de afinidade. Neste contexto, aplicou-se a cromatografia negativa com diaminas imobilizadas para purificação de IgG a partir do soro e plasma humano em uma única etapa, visando à obtenção de um alto grau de pureza. Os experimentos cromatográficos envolveram cinco etapas: condicionamento, alimentação, lavagem, eluição e regeneração da coluna cromatográfica. Para determinação do melhor ligante para adsorção de impurezas, realizaram-se ensaios com os adsorventes w-aminopropil-agarose, w-aminohexilagarose, w-aminohexil-bisoxirano-agarose, w-aminooctil-agarose, w-aminodecilbisoxirano- agarose, w-aminododecil-bisoxirano-agarose e DEAE-agarose na presença de diferentes sistemas tamponantes. De acordo com eletroforeses SDSPAGE e análises nefelométricas das frações dos picos de proteínas obtidos, a melhor condição utilizada para a purificação de IgG a partir de soro e plasma humano diluído em HEPES 25 mM a pH 6,8 e MOPS pH 7,9, respectivamente, em ?-aminohexil-bisoxirano-agarose, atingindo fator de purificação de 6,8 vezes e pureza superior a 95%. As isotermas de adsorção de albumina, principal impureza do soro e do plasma humano, ajustadas pelo modelo de Langmuir, indicaram alta capacidade de adsorção de albumina dos géis ?-aminohexil-bisoxirano-agarose e ?-aminodecil-bisoxirano-agarose, de 206,6 e 78,6 mg/mL de adsorvente, respectivamente. Os adsorventes ?-aminohexil-bisoxirano-agarose e ?- aminodecil-bisoxirano-agarose mostraram-se mais eficientes para purificação de IgG em termos de rendimento (76,8 e 74,7%, respectivamente) e capacidade dinâmica (4,23 e 4,51 mg de IgG/mL de adsorvente, respectivamente), do que o gel controle DEAE-agarose (51,9% de rendimento e 3,19 mg de IgG/mL de adsorvente). / Abstract: Immunoglobulins, in particular immunoglobulin G (IgG), have a broad application range and are essential to in vitro diagnostic tests, in therapies and researches in several fields. Many studies have been done aiming IgG purification, mainly using techniques of selective adsorption, such as ion exchange chromatography and negative affinity. In this context, the concept of negative chromatography with immobilized diamines was used for IgG purification from human serum and plasma in a single step, aiming to obtain high pure IgG. Chromatographic experiments involved five steps: conditioning, feeding, washing, elution and regeneration of the column. In order to determine the best condition for adsorption of impurities, trial experiments were performed with ?-aminopropylagarose, ?-aminohexyl-agarose, ?-aminooctyl-agarose, ?-aminodecyl-agarose, ?-aminododecyl-agarose and DEAE-agarose using different buffer systems. According to SDS-PAGE and nephelometry analysis, the most selective adsorbent was ?-aminohexyl-bisoxyrane-agarose using HEPES 25 mM pH 6.8 and MOPS pH 7.9 buffers for IgG purification from human serum and plasma, respectively, reaching purification factor of 6.8 times and purity of over 95%. Adsorption isotherms of albumin, main impurity of the human serum and plasma, adjusted by the Langmuir model, showed a high capacity of absorption of albumin by the gels w-aminohexyl-bisoxyrane-agarose and w-aminodecyl-bisoxyrane-agarose, of 206,6 and 78,6 mg/mL of adsorbent, respectively. The absorbents w-aminohexylbisoxyrane- agarose and w-aminodecyl-bisoxyrane-agarose showed more efficient for the purification of IgG regarding the yielding (76,8 and 74,7%, respectively) and dynamic capacity (4,23 and 4,51 mg of IgG/mL of absorbent, respectively), than the control gel DEAE-agarose (51,9% of yield and 3,19 mg of IgG/mL of adsorbent). / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T20:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pavan_GiseleLuiza_M.pdf: 8113456 bytes, checksum: 17ffd6547356e32bd63a48ccb9192979 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Imunoglobulinas são anticorpos secretados por células imunitárias em resposta a introdução de um antígeno. A imunoglobulina G (IgG) de origem humana, com alto grau de pureza, tem sido empregada como prescrição terapêutica para inúmeros casos de doenças malignas, infecciosas, auto-imunes e inflamatórias. Normalmente, a IgG é purificada através da precipitação com etanol seguida de cromatografia de afinidade com proteína A ou G imobilizada, no entanto, por apresentar alto custo, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas de afinidade alternativas. Membranas, nas quais podem ser imobilizados os ligantes de afinidade, tornam-se uma alternativa aos géis tradicionais apresentando maior capacidade hidrodinâmica. Neste contexto, estudou-se o efeito da remoção do sal em diferentes sistemas tamponantes na purificação de IgG a partir do soro humano por cromatografia de afinidade com íons imobilizados (IMAC), para o módulo de membranas de fibras ocas de PEVA-CM-Asp- Me2+, para os íons metálicos níquel e cobalto. De acordo com eletroforeses SDS-PAGE e análises de nefelometria das frações dos picos de proteína obtidos, a melhor condição utilizada para a purificação de IgG para os adsorventes PEVA-CM-Asp-Ni2+ e PEVA-CM-Asp-Co2+, foi em presença do sistema tamponante fosfato de sódio 25 mmol L-1 e imidazol 2 mmol L-1 a pH 7,0 utilizando o aumento da concentração de imidazol como estratégia de eluição, alcançando pureza superior a 93% para ambos íons metálicos. Determinada a melhor condição de purificação, por meio das isotermas de adsorção, foi determinada a capacidade máxima de adsorção e a constante de dissociação dos complexos CM-Asp-Ni2+-IgG e CM-Asp-Co2+-IgG que, de acordo com o ajuste dos parâmetros pelo modelo de Langmuir e Langmuir-Freundlich, demonstraram boa capacidade de adsorção e constantes de dissociação características de sistemas utilizando ligantes pseudobioespecíficos. Para as filtrações em módulo de fibras ocas, construído em nosso laboratório, determinaram-se as curvas de ruptura, sendo que os resultados obtidos para as membranas finamente cortadas foram melhores que os obtidos para os de filtração em módulo de fibras ocas / Abstract: Immunoglobulins are secreted by immune cells in response to the introduction of an antigen. Immunoglobulin G (IgG) obtained from human sources with high purity has been used as therapeutic prescription for many cases of malicious, infectious, autoimmune and inflammatory diseases. Typically, IgG is purified by precipitation with ethanol followed by affinity chromatography with immobilized protein A or G, however, due to its high cost, it is necessary to develop alternative techniques based on affinity. Affinity membranes, which may be immobilized on the affinity ligands, show a higher hydrodynamic capacity than typical gels. In this context, the effect of salt was studied in different buffer systems in the purification of IgG from human serum by Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography (IMAC) for the module PEVA-CM-Asp-Me2+ using ions Ni2+ and Co2+. According to SDS-PAGE and nephelometric analysis fractions of protein peaks obtained, the best condition used for purification of IgG to the adsorbents PEVA-CM-Asp-Ni2+ and PEVA-CM-Asp-Co2+ was in the presence of sodium phosphate buffer system 25 mmol L-1 and 2 mmol L-1 imidazole at pH 7.0 using increasing concentration of imidazole as elution strategy, achieving a purity higher than 93% for both metal ions. The maximum adsorption capacity and dissociation constant of complexes CM-Asp-Ni2+-IgG and CM-Asp-Co2+-IgG by adsorption isotherms were determined on the best condition of purification and the adjustment of parameters by the Langmuir and Langmuir-Freundlich models, it demonstrated good adsorption capacity and dissociation constants characteristics of systems using pseudobioespecific ligands. For filtration in hollow fiber module, constructed in our laboratory, breakthrough curves were determined; also for the best condition of purification, and the results for finely chopped membranes were better than those obtained for the filtration module and hollow fibers / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:23:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carmignotto_GabrielaPannunzio_M.pdf: 6143089 bytes, checksum: aa61b4762764a38220fc51226e410a80 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os fragmentos Fab de imunoglobulina G são utilizados principalmente em testes diagnósticos e terapias. Por apresentarem tamanho reduzido, os fragmentos Fab possuem maior facilidade de penetração em tecidos e maior velocidade de circulação no plasma quando comparados à IgG intacta. A purificação dos fragmentos Fab é realizada geralmente por cromatografia de afinidade utilizando os ligantes bioespecíficos proteína A, proteína G e proteína L. Entretanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, entre elas seu elevado custo e a necessidade de eluição em condições drásticas. Como alternativa, muitos estudos têm sido realizados empregando ligantes pseudobioespecíficos e de interação mista visando o desenvolvimento de novas estratégias que proporcionem a purificação dos fragmentos Fab. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo avaliar a seletividade das poliaminas ?-aminohexil e poli(etilenoimina) imobilizadas em gel de agarose na separação de fragmentos Fab humano a partir de uma solução de IgG humana clivada enzimaticamente, empregando diferentes sistemas tamponantes. A recuperação seletiva dos fragmentos Fab foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE, Western blot e imunodifusão radial. Os resultados indicaram que nas cromatografias realizadas em gel ?-aminohexil-agarose em Tris-HCl a pH 8,0, os fragmentos Fab foram recuperados nas frações não retidas, com valores calculados de pureza de 97% e recuperação de 100%. Nas cromatografias realizadas em gel PEI-agarose empregando o tampão Tris-HCl nos valores de pH de 7,5 e 8,0, a pureza obtida foi de 96% e a recuperação foi de 94% e 93%, respectivamente. As curvas de ruptura para os adsorventes foram determinadas e os resultados obtidos indicaram melhor recuperação do fragmento Fab com alta pureza no flowthrough para o ligante ?-aminohexil (2,7 mg) quando comparado ao ligante PEI (0,8 mg). A isoterma de adsorção de fragmentos Fc para o adsorvente ?-aminohexil-agarose foi determinada e os parâmetros capacidade de adsorção de 44,32 mg.mL-1 de gel e constante de dissociação de 1,11.10-5 mol.L-1 foram obtidos por ajuste destes parâmetros segundo o modelo de Langmuir-Freundlich. O valor de n obtido foi igual a 1,68, indicando cooperatividade positiva na adsorção dos fragmentos Fc e IgG não clivada. Os resultados mostraram que as poliaminas ?-aminohexil e PEI apresentaram potencial como ligantes para a purificação de fragmentos Fab / Abstract: Fab fragments from immunoglobulin G are considered an important tool for the therapy and diagnose of diseases. Their reduced molecular size is an advantage over the intact IgG allowing faster tissue penetration and circulation in the plasm. Fab fragments are often purified by affinity chromatography using biospecifics ligands, such as protein A, protein G, and protein L. However, the use of those ligands is hindered by their high costs and elution in drastic conditions. Several studies have been performed for the development of new techniques to improve the chromatographic purification of Fab fragment, e.g., using pseudobiospecifics or mix-mode ligands. In this context, we have evaluated the efficiencies of polyamines ?-aminohexyl and poly(ethyleneimine) (PEI) ligands immobilized in agarose gel aiming the purification of human Fab fragments. Our chromatographic studies were conducted feeding cleaved human IgG solution into the aforementioned adsorbents using different adsorption buffers and conditions. The selectivity towards Fab fragments was evaluated using SDS-PAGE, Western blot, and radial immunodiffusion. The chromatography performed with ?-aminohexyl-agarose using Tris-HCl buffer pH 8.0 recovered 100% of the Fab fragments with 97% of purity. Studies done with adsorbent PEI-agarose using Tris-HCl pH 7.5 and 8.0 as adsorption buffers recovered 94% and 93% of Fab fragments, respectively, with 97% of purity. Breakthrough curves experiments showed that the ?-aminohexyl ligand was superior than PEI ligand in terms of recovering Fab fragment with high purity in flowthrough (2.7 mg against 0.8 mg, respectively). The adsorption isotherm of ?-aminohexil-agarose adsorbent was determined adjusted by the Langmuir-Freundlich model as well (Qm: 44.32 mg.mL-1 of gel; Kd: 1.11.10-5 mol.L-1). Additionally, Fc fragments and IgG binding showed positive cooperativity (n=1.68). All these results indicate that ?-aminohexyl and PEI polyamines are potential ligands for the purification of Fab fragments and can possibly improve the existing techniques employed for this purpose / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

O objetivo do presente estudo foi avaliar a transferência de imunidade passiva, saúde e o desempenho de bezerros colostrados com diferentes doses de imunoglobulinas provenientes do substituto de colostro SCCL&#174; ou colostro materno. Os animais foram separados das mães imediatamente após o nascimento. Cinquenta bezerros da raça holandesa (machos e fêmeas) foram alocados em blocos casualizados de acordo com sexo, peso ao nascer e data de nascimento e distribuídos em diferentes protocolos de colostragem: 1) 2L de colostro materno (2CM); 2) 4L de colostro materno (4CM); 3) 2L de colostro materno + uma dose do substituto de colostro (2MC1SC); 4) 2 doses substituto de colostro ao nascer (2SC); e 5) 2 doses substituto de colostro ao nascer + uma dose substituto de colostro entre 6 a 8 horas após nascimento (3SC). Foram colhidas amostras de sangue ao nascimento, antes do fornecimento do colostro (0h) e com 48h após a ingestão do colostro para avaliar a transferência de imunidade passiva. Durante o período de aleitamento os bezerros receberam 6L/d de sucedâneo, tiveram acesso ad libitum à água e concentrado e foram alojados em abrigos individuais, tipo tropical. O consumo de concentrado foi avaliado diariamente, e semanalmente avaliou-se o peso e medidas corporais. A saúde dos animais foi monitorada diariamente e a incidência de diarreia foi avaliada através do escore fecal. Durante o aleitamento as amostras de sangue foram colhidas a cada 14 dias, para determinação de proteína total, albumina, glicose, BHBA, AGNE e insulina. A transferência de imunidade passiva não foi afetada pelos protocolos de colostragem (P>0,05). No entanto, doses mais elevadas de colostro resultaram em maior ingestão de imunoglobulinas, porém reduz a eficiência aparente de absorção (P <0,0001). Da mesma forma, os protocolos de colostragem não afetaram os parâmetros de saúde como escore fecal (P=0,5873), dias com diarreia (P=0,3685), dias com febre (P=0,7072); número de tratamentos para diarreia (P=0,8499) e o número de tratamentos para pneumonia (P>0,005). No entanto, afetou o número de tratamentos contra tristeza parasitária bovina (P=0,0042). O peso médio e o GMD, assim como os parâmetros sanguíneos avaliados durante o aleitamento, não foram afetados pelos protocolos de colostragem (P> 0,05). O substituto de colostro avaliado no presente estudo pode ser uma alternativa ao colostro materno, uma vez que, tanto o colostro materno como o substituto de colostro foram eficientes na transferência de imunidade passiva, resultando em desempenho similar mesmo em condições de alto desafio sanitário. / The objective of the present study was to evaluate the passive transfer of immunity (PTI), health and performance of calves fed different doses of immunoglobulins from the SCCL&#174; colostrum replacer or maternal colostrum. The animals were separated from the mothers immediately after birth. Fifty holstein calves (male and female) were allocated in randomized blocks according to sex, birth weight and date of birth and were distributed among different colostrum feeding protocols: 1) 2L of maternal colostrum (2MC); 2) 4L of maternal colostrum (4MC); 3) 2L of maternal colostrum + one dose of colostrum replacer (1MC+1CR); 4) 2 doses of colostrum replacer (2CR) and 5) 2 doses of colostrum replacer given at birth + one dose of colostrum replacer given between 6 and 8 hours after birth (3CR). Blood samples were taken at birth, before colostrum fed (0h) and at 48h after colostrum intake to assess passive immunity transfer. Calves were individually housed and bucket fed 6L/d of milk replacer, and had ad libitum access to water and starter. Starter intake was measured daily, and weekly assessed weight and body measurements. Animal health was monitored daily and the incidence of diarrhea was assessed by fecal score. During the pre-weaning, blood samples were harvested every 14 days to for determination of total protein, albumin, glucose, BHBA, NEFA and insulin. The passive transfer of immunity was not affected by colostrum feeding protocols (P>0.05). However, higher doses of colostrum resulted in higher immunoglobulins intake, but lower apparent efficiency absorption (P<0.0001). Similarly, the colostrum feeding protocols did not affect health parameters (P>0.05), such as fecal score (P=0,5873), days with diarrhea (P=0,3685), days with fever (P=0,7072), number of treatments for diarrhea (P=0,8499) and number of treatments for pneumonia (P>0,005). However, affected the number of treatments for cattle tick fever (P=0.0042). The mean weight and ADG, as well as the blood parameters evaluated during pre-weaning were not affected by the colostrum feeding protocols (P> 0.05).The colostrum replacer evaluated in this study may be an alternative to maternal colostrum, once the, both maternal colostrum and colostrum replacer were efficient in the transfer of passive immunity, resulting in similar performance even under conditions of high sanitary challenge.