Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-08T05:04:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_MarianaBorsoi_D.pdf: 5252506 bytes, checksum: b9eb50542c7fa4e04b6b4c83526b4ccc (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: As imunoglobulinas do isotipo G (IgG) são usadas enOlmemente em aplicações terapêuticas e são requeridas, usualmente, com um elevado grau de pureza. V álias técnicas cromatográficas vêm sendo investigadas para a purificação de IgG a partir do plasma humano. Neste trabalho, investigou-se o efeito dos agentes quelantes ácido iminodiácetico (IDA), ácido aspártico carboxi-metilado (CM-Asp) e TIis-2(aminoetil)amina (TREN) na purificação de IgG a partir do plasma humano utilizando a técnica de cromatografia de afinidade com os íons metálicos imobilizados em membranas de fibras ocas. Para tanto, foram realizados experimentos de adsorção em diferentes sistemas tamponantes em membranas de álcool de poli(etileno) vinílico (PEV A) finamente c011adas e em módulos de filtração derivatizados com IDA, TREN e CM-Asp, utilizando-se os íons metálicos níquel e cobre. A seletividade dos adsorventes foi verificada por eletroforese SDS-P AGE e análise nefelométrica. As melhores condições de purificação foram encontradas utilizando-se as membranas PEV A-CM-Asp-Ni(II) em módulo de filtração, em presença do tampão TrisHCI 25 mM pH 7,0 e eluição por acréscimo da concentração de TIis, sendo obtida IgG com aproximadamente 90% de pureza. As membranas de PEV A-CM-Asp-Ni(II) em módulos de filtraçã? apresentaram melhor seletividade, segundo eletroforese SDS-P AGE, e capacidade dinâmica de adsorção maior comparadas às membranas finamente cortadas (capacidade média de adsorção: 53,0 e 7,7 mg de IgG pOT g seca de membrana, respectivamente). O modelo de LangmUir ajustou-se às isotermas de adsorção, à temperatura ambiente, mostrando alta capacidade de adsorção para os sistemas PEV A-IDA-Ni(II) e PEV A-CM Asp-Ni(II) (204,6 e 302,3 mg/g seca de membrana, respectivamente) e constantes de dissociação característica de sistemas de média afinidade (6, I e 10,1 x 10-6 M, respectivamente). A análise dos parâmetros termodinâmicos encontrados para o sistema modelo PEV A-IDA-Ni(II)-IgG, indicaram a complexidade das interações, indicando a existência de interações hidrofóbicas, eletrostáticas e de ligações de coordenação. Neste trabalho, conseguiu-se purificar IgG a partir do plasma humano em! uma única etapa, utilizando-se a técnica da cromatografia em membranas de afinidade, demonstrando a alta potencialidade da utilização do método desenvolvido em processos industriais / Abstract: The use of immunoglobulin G (lgG) in therapeutic applications has growing vastly and it is used in the treatment of a growing number of indications. Several chromatographic techniques have been investigated for IgG purification. In this work, we investigated the effect of the chelators iminodiacetic acid (IDA), carboxymethylaspartate acid (CM-Asp) and Tris-2(aminoethyl)amine (TREN) for IgG purification, from human plasma using Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography (IMAC) technique using hollow fibers membranes as support to the chromatographic experiments. For that, adsorption experiments were done, using different buffers systems, on filtration module and on finely cut poly(ethylene) vinyl alcohol (PEV A) membranes containing chelators IDA, TREN and CM-Asp with the metallic ions nickel and copper. The adsorbent selectivity was verified through electrophoresis SDS-PAGE and nefelometric analysis. Best purification conditions were found with PEV A-CM-Asp-Ni(ll) filtration module in the presence of 25 mM Tris HCI pH 7.0 and elution by increasing Tris concentration. In this case, it was possible to obtain IgG with approximately 90% of purity. According to electrophoresis SDS-P AGE and nefelometric analysis, PEV A-CM-Asp-Ni(ll) filtration modules showed better selectivity and superior adsorption dynamic capacity for IgG than those obtained by finely cut membranes (medium adsorption capacity: 53.0 and 7.7 mg of IgG /g of dry membrane, respectively). Lagmüir model adjusted to adsorption isotherms at room temperature (250 C), showed high adsorption capacity for PEV A-IDA-Ni(ll) and PEV A-CM-Asp-Ni(ll) systems (204.6 and 302.3 mg/g dry of membrane, respectively) and showed dissociation constants characteristic of medium affinity systems (6.1 and 10.1 x 10-6 M, respectively). The thermodynamic parameters analysis obtained for PEV A-IDA-Ni(ll)-lgG system indicated the complexity of the interactions, and the existence of hydrophobic and electrostatics interaction besides the coordination bound. In this work, we could purify IgG from human plasma in a single stage, using the affinity chromatographic membranes technique, allowing in this way, the treatment of great volumes per unit of time, showing the high potentiality of this method in industrial processes / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-16T12:31:22Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fábio de Castro Bezerra - 2015.pdf: 1134192 bytes, checksum: 61d0dd74a6363dfdeccf24d48ee39e2d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-16T12:32:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fábio de Castro Bezerra - 2015.pdf: 1134192 bytes, checksum: 61d0dd74a6363dfdeccf24d48ee39e2d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T12:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fábio de Castro Bezerra - 2015.pdf: 1134192 bytes, checksum: 61d0dd74a6363dfdeccf24d48ee39e2d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / (Sem resumo em outra língua) / Este trabalho teve por objetivo estudar a interação entre moléculas orgânicas e anticorpos visando seu uso em sistemas de entrega de fármacos e diagnóstico fluorescente. Foram investigadas moléculas orgânicas de porfirinas e anticorpos reativos a Herpesvírus bovino, micro-organismo amplamente disseminado em rebanhos de corte e leite. Para o desenvolvimento deste projeto foram empregadas técnicas espectroscópicas de absorção UV/Vis, emissão fluorescente e espalhamento ressonante. Os resultados obtidos apresentaram indícios de que a ligação entre as porfirinas e os anticorpos ocorre. As constantes de ligação associadas à essa interação sugeriram alta afinidade das porfirinas pelos anticorpos. As investigações da conformação dos anticorpos indicaram que a sua estrutura enovelada não é significativamente afetada pelas porfirinas e os estudos de Transferência de Energia Ressonante de Förster sugeriram que esse mecanismo pode ser o principal responsável pela supressão da fluorescência dos anticorpos pelas porfirinas.

Os efeitos protetores da imunidade humoral são medidas por uma família de glicoproteínas chamadas anticorpos ou imunoglobulinas. As preparações de imunoglobulina G (IgG) utilizadas em nosso país são importantes. No Brasil, a primeira preparação de IgG foi obtida na Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo em 1993. O presente estudo avaliou preparações de IgG obtidas de misturas de plasma humano de variadas procedências, inclusive a preparação obtida no Brasil. Foram avaliados os seguintes parâmetros: concentração protéica, distribuição das subclasses da IgG, atividade de anticorpos específicos e segurança quanto a agentes patogênicos transmissíveis pelo sangue. Em algumas preparações, a concentração protéica de IgG e a distribuição das suas subclasses estavam fora das especificações. As preparações apresentaram atividade de anticorpos específicos contra os vírus das hepatites A e B, do herpes simples, da rubéola, citomegalovírus; contra a bactéria Streptococcus pyogenes β-hemolítico do grupo A e contra o parasita Toxoplasma gondii. A qualidade de matéria-prima utilizada em algumas das preparações de IgG não foi adequada em função de reações positivas para anticorpos contra alguns agentes infecciosos, tais como HTLV I/II, HAV, HBV, HCV e Treponema pallidum. Esse estudo também mostrou a necessidade de se implantar urgente um programa abrangente para avalição das preparações de IgG a serem consumidas pela população brasileira. / A family of glicoproteins, which are called antibodies or immunoglobulins (IgG), mediates the protective effects of humoral immunity. In Brazil, the IgG for intravenous use are imported from other countries. The first Brazilian immunoglobulin G for therapheutic use was obtained from human plasma at the Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo. The present study was carried out to evaluate different preparations of IgG, human plasmad-derived, include the preparation from Brazil. The protein concentration, IgG subclass distribution, specific antibody activities and safety regarding the main blood transmitted infectious diseases were analyzed. In some preparations, IgG protein concentration and subclass distribution were different from their specifications. Some preparations showed specific antibody activity against the following antigens: A and B hepatitis virus, rubella, herpes simplex virus, citomegalovirus, measles virus, Streptococcus pyogenes β-hemolytic group A and Toxoplasma gondii. The presence of antibodies against antigens such as HTLV I/II, HAV, HBV, HCV and Treponema pallidum has compromissed the quality guaranty of the material-source (plasma) used in some preparations. This study has also showed that a complete and effective program for the quality evaluation of IgG preparations used in Brazil is needed and should be urgently established

Os efeitos protetores da imunidade humoral são medidas por uma família de glicoproteínas chamadas anticorpos ou imunoglobulinas. As preparações de imunoglobulina G (IgG) utilizadas em nosso país são importantes. No Brasil, a primeira preparação de IgG foi obtida na Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo em 1993. O presente estudo avaliou preparações de IgG obtidas de misturas de plasma humano de variadas procedências, inclusive a preparação obtida no Brasil. Foram avaliados os seguintes parâmetros: concentração protéica, distribuição das subclasses da IgG, atividade de anticorpos específicos e segurança quanto a agentes patogênicos transmissíveis pelo sangue. Em algumas preparações, a concentração protéica de IgG e a distribuição das suas subclasses estavam fora das especificações. As preparações apresentaram atividade de anticorpos específicos contra os vírus das hepatites A e B, do herpes simples, da rubéola, citomegalovírus; contra a bactéria Streptococcus pyogenes β-hemolítico do grupo A e contra o parasita Toxoplasma gondii. A qualidade de matéria-prima utilizada em algumas das preparações de IgG não foi adequada em função de reações positivas para anticorpos contra alguns agentes infecciosos, tais como HTLV I/II, HAV, HBV, HCV e Treponema pallidum. Esse estudo também mostrou a necessidade de se implantar urgente um programa abrangente para avalição das preparações de IgG a serem consumidas pela população brasileira. / A family of glicoproteins, which are called antibodies or immunoglobulins (IgG), mediates the protective effects of humoral immunity. In Brazil, the IgG for intravenous use are imported from other countries. The first Brazilian immunoglobulin G for therapheutic use was obtained from human plasma at the Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo. The present study was carried out to evaluate different preparations of IgG, human plasmad-derived, include the preparation from Brazil. The protein concentration, IgG subclass distribution, specific antibody activities and safety regarding the main blood transmitted infectious diseases were analyzed. In some preparations, IgG protein concentration and subclass distribution were different from their specifications. Some preparations showed specific antibody activity against the following antigens: A and B hepatitis virus, rubella, herpes simplex virus, citomegalovirus, measles virus, Streptococcus pyogenes β-hemolytic group A and Toxoplasma gondii. The presence of antibodies against antigens such as HTLV I/II, HAV, HBV, HCV and Treponema pallidum has compromissed the quality guaranty of the material-source (plasma) used in some preparations. This study has also showed that a complete and effective program for the quality evaluation of IgG preparations used in Brazil is needed and should be urgently established

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neosporosis is a parasitic disease of wide distribution and great importance to the cattle industry, mainly due to its associated reproductive losses. The life cycle of Neospora caninum typified by the tree know infectious stages: tachyzoites, tissue cysts with bradyzoites, and oocysts. Transmission routes can be horizontal and/or vertical. The vertical transmission or transplacentally is the most frequent form of infection, and an important form of maintain the agent in herds. With aim of to determine the occurrence of anti-Neospora caninum antibodies in serum samples of 260 bovine fetuses, collected in a slaughter in the municipality of Santa Maria, in Rio Grande do Sul, Brazil. For detection antibodies anti-N. caninum indirect fluorescent antibody test was used and immunoglobulin G and M were detected, using a cut-off 1:25. Of the 260 serum samples tested, 15% (39/260) were positive for the presence of anti-N. caninum. Of these, in 38 the presence of IgG where detected (97.4%) and in six IgM were present (10.3%). Five samples (15.4%) tested were positive for both IgG and IgM. The results reaffirming the ability of N. caninum in determine fetal infection. The results presented on the first chapter indicated that the search of IgM anti-N. caninum is of very limited help in the detection of the transplacental infection in cattle. In second chapter, was evaluated the susceptibility to infection by N. caninum in different cell cultures, for the purpose of observe the ability in vitro multiplication this agent. For this, eight cell cultures were tested, among the cell cultures tested, four presented good susceptibility to agent: cell lines VERO (yield of 21.2 tachyzoites/cell) and MA-104 (17.1); primary bovine testicle (16.3) and lung cells (13.6). Primary bovine kidney (8.2 tachyzoites/cell), MDBK (5.1) and RK-13 cell lines (0.4) presented moderate to low sensitivity. No viable tachyzoites were detected in the culture of MDCK cells. These results demonstrate that MA-104 cells present adequate susceptibility to N. caninum compared to VERO cells, which have been largely used to multiply the parasite in vitro. Due to the easy manipulation, quick multiplication and relatively low nutritional equirements, these results indicate that MA-104 cells are adequate for multiplication of N. caninum in vitro. / A neosporose é uma doença parasitária de ampla distribuição e com grande importância para a bovinocultura, principalmente pelas perdas reprodutivas que determina. O ciclo do Neospora caninum caracteriza-se por apresentar três estágios infecciosos: os taquizoítos, os cistos teciduais contendo bradizoítos e os oocistos. Suas rotas de transmissão podem ser horizontal e/ou vertical. A infecção vertical ou transplacentária é a forma mais freqüente de infecção, sendo uma importante forma de manutenção do agente nos rebanhos. Com o objetivo de determinar a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em fetos bovinos, foram coletadas 260 amostras de soro em abatedouro localizado no município de Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Para detecção de anticorpos anti-N. caninum, utilizou-se a técnica de imunofluorescência indireta com a presença de imunoglobulinas G e M (IgG e IgM), sendo analisada com ponto de corte de 1:25. Do número total de amostras testadas, 15% (39/260) foram positivas para anticorpos anti-N. caninum. Destas, em 38 (97,4%) foi detectada a presença de IgG anti-N. caninum e em seis (15,4%) de IgM. Em cinco amostras (12,8%) detectaram-se ambos, IgG e IgM. Os resultados reafirmam a capacidade do N. caninum determinar infecção fetal. Os resultados obtidos no primeiro capítulo desta dissertação permitiram demonstrar que a pesquisa de IgM foi de limitada importância na detecção da infecção via transplacentária em soro fetal bovino. No segundo capítulo, foi avaliada a susceptibilidade à infecção pelo N. caninum em diferentes cultivos celulares, com a finalidade de observar a capacidade de multiplicação deste agente in vitro. Para isto, foram testados oito cultivos, sendo que quatro apresentaram boa susceptibilidade a multiplicação pelo N. caninum: células VERO (produção de 21,2 taquizoítos/célula), MA-104 (17,1), cultivo primário de testículo (16,3) e pulmão bovino (13,6). O cultivo primário de rim bovino (8,2), células MDBK (5,1) e RK-13 (0,4) apresentaram baixa sensibilidade, enquanto células MDCK não produziram taquizoítos viáveis. Os resultados obtidos demonstram que as células MA-104 apresentaram susceptibilidade semelhante a das células VERO linhagem tradicionalmente utilizada para o cultivo deste protozoário. Pela facilidade de cultivo e rápida multiplicação, menor exigência nutricional e produção de taquizoítos em níveis semelhantes às células VERO, as células MA-104 demonstraram ser adequadas para a manutenção e multiplicação do N. caninum in vitro.