Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Coorientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Ana Lúcia Abreu Silva / Banca: Hélio José Montassier / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de distribuição mundial. No Brasil foi descrita em várias regiões, mas na região sudeste vem ocorrendo de forma significativa desde 1998, na região de Araçatuba, SP. O cão é o principal reservatório doméstico do protozoário Leishmania chagasi e a principal fonte de contaminação para o homem. A resposta imune do hospedeiro canino frente ao parasito é variável e por este fato, os cães apresentam sinais clínicos acentuados ou ausência destes. Os animais que apresentam maior carga parasitária e sinais clínicos mais severos são considerados susceptíveis à infecção pelo parasito. Este padrão está associado ao perfil de citocinas produzidas, ou seja, na predominância de citocinas Th1 são resistentes ou Th2 susceptíveis. No entanto existem muitas variações neste padrão de resposta, ou seja, muitos animais apresentam a produção de citocinas Th1 e Th2, sugerindo um desequilíbrio na proporção de citocinas pró e antiinflamatórias, que favorecem a multiplicação e sobrevivência dos parasitos. Este desequilíbrio tem influência direta sobre a ativação de macrófagos e sobre sua capacidade microbicida e de apresentação antigênica, levando a uma anergia de linfócitos T e a manutenção e cronicidade da infecção. As quimiocinas são citocinas com potente atividade quimiotática sobre leucócitos. Na LV existem estudos no homem e em modelos experimentais, mas no cão apenas um estudo avalia o seu papel no baço. Existe muita controvérsia sobre o seu verdadeiro papel na LV, pois descreve-se tanto a sua ação próinflamatória quanto a sua ação deletéria, que favorece o parasito. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel das quimiocinas MIP-1a e MCP-1 no baço e fígado de 30 cães... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis of worldwide distribution. In Brazil has been described in several regions, but has been occurring in the Southeast significantly since 1998 in Araçatuba, SP. The dog is the main domestic reservoir of Leishmania chagasi and the main source of contamination for humans. The canine host immune response against the parasite is variable. Dogs have severe intensity or absence of clinical symptoms. Animals that have a higher parasite load and clinical signs are considered more susceptible to infection by the parasite. This pattern is associated with the profile of cytokines produced, in the predominance of Th1 they are resistant or in the predominance of Th2 they are susceptible. However there are many variations on this response pattern, many animals have the production of Th1 and Th2 cytokines, suggesting an imbalance in the proportion of pro and anti-inflammatory cytokines, which favor the multiplication and survival of parasites. This imbalance has a direct influence on the activation of macrophages and their microbicidal activity and antigen presentation, leading to anergy of T lymphocytes and the maintenance and chronicity of infection. Chemokines are cytokines with potent chemotactic activity on leukocytes. In the VL are studies in humans and experimental models, but the dog only one study assessing its role in the spleen. There is much controversy over its true role in VL, because it describes both its pro-inflammatory action and its deleterious effects, which favors the parasite. Therefore, the aim of this study was to evaluate the role of chemokines MIP-1α and MCP-1 in the spleen and liver of 30 dogs naturally infected with Leishmania spp. and compare the findings with the parasite load of each organ. For this purpose, samples of liver and spleen were analyzed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Coorientador: Gisele Fabrino Machado / Banca: Daniel Cortes Beretta / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Resumo: Os cães infectados pelo protozoário Leishmania (Leishmania) chagasi podem ou não apresentar sinais clínicos dessa zoonose e são a principal fonte de infecção para o homem. A pele é o primeiro órgão infectado pelo parasito na LVC. As enzimas metaloproteinases da matriz (MMPs) atuam na degradação da matriz extracelular (MEC) e na modulação da resposta inflamatória, frente a vários tipos de injúrias. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de MMP-2 e MMP-9, por meio da técnica de imuno-histoquímica e zimografia na pele de cães naturalmente acometidos por LVC e comparar estes resultados com a imunodetecção das citocinas TNF- e TGF- e do protozoário Leishmania, com as possíveis alterações da matriz extracelular dermal. A alteração da composição de fibras colágenas da derme foi avaliada pela coloração PicroSirius. O método foi usado para diferenciar fibras colágenas dos tipos I e III, nas regiões do focinho, orelha e abdômen. A carga parasitária, intensidade de inflamação e a produção de MMP 2 e 9 foram maiores nas regiões cutâneas da orelha e focinho. Os macrófagos, linfócitos e plasmócitos predominaram no infiltrado inflamatório da derme superficial, formando granulomas, associados a degradação do colágeno maduro (tipo I) e a discreta deposição de colágeno jovem (tipo III), com maior intensidade nos cães com elevada carga parasitária cutânea. O TGF-β foi detectado nos três grupos de cães infectados (assintomático, oligossintomático e sintomático), sem diferenças significativas entre eles. O TNF-α não foi detectado na maioria dos animais infectados e no grupo controle. Conclui-se que quanto maior a carga parasitária e a intensidade de inflamação na pele, maior a degradação do colágeno maduro, produção de MMPs 2 e 9 e produção de TGF-β. A MMP-9 ativa poderia ser utilizada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dogs infected by Leishmania (Leishmania) chagasi may or may not show clinical signs of the zoonosis and they are the main source of infection for man. The skin is the first organ infected by the parasite in the LVC. The enzyme matrix metalloproteinases (MMPs) act on the degradation of extracellular matrix (ECM) and in the inflammatory response modulation against many kinds of injuries. The aim of this study was to evaluate the expression of MMP-2 and MMP-9 by immuno-histochemistry and zymography in the skin of dogs naturally affected by LVC and the immunodetection of TNF- and TGF- and of Leishmania and compare these results with the possible alterations of dermal extracellular matrix. The method was used to differentiate collagen fibers in the dermis was evaluated by Picrosirius red staining to differentiate collagen types I and III, in regions of the nose, ear and abdomen. The parasite load, intensity of inflammation, increased production of MMP 2 and 9 were higher in regions of the ear and muzzle. Macrophages, lymphocytes and plasma cells predominated in the inflammatory infiltrate of the superficial dermis, forming granulomas, associated with degradation of mature collagen (type I) and the discrete deposition of the young collagen (type III), with greater intensity in dogs with high parasite load skin. The TGF-β was detected in all groups of infected dogs (asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic), no significant differences among them. The TNF-α was not detected in most infected animals and the control group. It follows that the greater is the intensity of parasitic load and inflammation of the skin, the greater is the degradation of mature collagen, the production of MMPs and 2 and 9, production of TGF-β. Active MMP-9 could be used as a marker of inflammation in infected dogs. This profile of the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientadora: Mary Marcondes / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Áureo Evangelista Santana / Banca: Vera Lúcia Fonseca de Camargo-Neves / Banca: Carlos Eduardo Larsson / Resumo: O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / Abstract: The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs. / Doutor

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Isabel Kinney Ferreira de Miranda Santos / Resumo: A leishmaniose visceral é uma zoonose, considerada como uma entre seis doenças tropicais mais importantes nos países em desenvolvimento. O agente etiológico da enfermidade no Brasil, a Leishmania chagasi, é transmitida pela picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, que adquire o parasito ao realizar o hematofagismo em animais infectados. No ambiente doméstico, o cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose visceral e, em consequência disso, é também o principal alvo das campanhas de controle da forma humana da doença. Neste trabalho foi avaliado o potencial diagnóstico para a leishmaniose visceral canina de um antígeno recombinante, produzido a partir do gene de uma proteína, isolado em L. chagasi, amostra Jaboticabal. O gene isolado apresenta similaridade com a família A2 de L. chagasi e foi expresso utilizando o vetor pET28a em E. coli. A proteína de 11 KDa expressa, foi avaliada pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). O ELISA com o antígeno recombinante His6_A2 detectou anticorpos anti-A2 em 52% dos cães infectados com L. chagasi. Enquanto que, 67% dos soros de animais vacinados e 65% dos animais de áreas-não endêmicas, foram negativos pelo ELISA_A2. Os testes de Western-blotting e Dot-ELISA realizado com soros de camundongos inoculados com essa proteína His_A2 demonstrou resultados positivos de antigenicidade e imunogenicidade. Todos os sequenciamentos de DNA mostraram homologia com genes da família A2. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a zoonosis and one of six most important tropical diseases in developing countries. The causative agent of the disease in Brazil, Leishmania chagasi, is transmitted by the bite of the sandfly Lutzomyia longipalpis, who acquired the parasite biting infected animals. In domestic environment, the dog is considered the main reservoir of visceral leishmaniasis, and in consequence it is also the main target of campaigns to control the disease in human beings. This study evaluated the potential of a recombinant antigen produced from the A2 gene Jaboticabal strain L. chagasi for diagnosis of canine visceral leishmaniasis (LVC). The isolated gene showed similarity with L. chagasi family A2 gene, and was expressed using pET28a expression vector in E. coli. The 11-kDa protein expressed was evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using known positive and negative sera, previously tested by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). The His-A2 recombinantantigen detected anti-A2 antibodies in 52% of L. chagasi infected dogs. Seventy-seven percent of vaccinated dogs and 65% of dogs from non-endemic areas were both negative by A2-ELISA. The antigenicity and immunogenicity of the expressed protein was confirmed by Western blot and Dot-ELISA assays, performed using sera from mice inoculated with this protein. / Mestre

Orientadora: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de interesse em saúde pública e o cão é o principal reservatório doméstico de Leishmania chagasi. Este protozoário modula a resposta imune do hospedeiro. A citocina MIF favorece a permanência do macrófago no sítio da injúria e protege-o da apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de MIF nos linfonodos de cães com LV, comparando estes achados com a densidade de macrófagos parasitados nos linfonodos e com o estadiamento clínico dos cães. Neste estudo utilizou-se 33 cães oriundos de Araçatuba, município endêmico para a LV. Os cães foram distribuídos nos grupos assintomático (A), oligossintomático (O) e sintomático (S). As alterações morfológicas dos linfonodos poplíteo, subescapular, ilíaco e mesentérico foram avaliadas quanto ao perfil celular, determinado por escores. A carga parasitária e a imunodetecção de MIF foi feita pela técnica de imuno-histoquímica. Nos cães dos grupos com sinais clínicos (O e S), as reações inflamatória granulomatosa e plasmocitária foram predominantes. No grupo S, a atrofia linfóide predominou e associou-se ao maior número de granulomas e a maior carga parasitária. A densidade de parasitos nos linfonodos periféricos diferiu significativamente do grupo S para os demais grupos (P<0,05). A densidade de macrófagos imunomarcados com MIF foi maior no grupo S e apresentou uma correlação significativa com a carga parasitária no linfonodo poplíteo (P<0,05). Conclui-se que macrófagos são uma das células mais envolvidas na resposta ao parasito. O protozoário utiliza MIF para manter o macrófago no sítio de infecção, favorecendo a sua sobrevivência no hospedeiro / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic disease critical for the public health and the dog is the main Leishmania chagasi„s domestic reservoir. This protozoan modulates the immune response of the host. The MIF cytokine facilitates the permanence of the macrophage in the site of injury and protects it from apoptosis. The aim of this study was to evaluate the MIF presence in the lymph nodes of dogs with VL, comparing these findings with the parasite density in the lymph nodes and with the clinical outcome of the dogs. Third three dogs from Araçatuba, an endemic city for VL, were used in this study. Dogs were distributed in the asymptomatic (A), oligosymptomatic (O) and symptomatic (S) groups. The cellular profile of the morphologic changes of the popliteal, subscapular, iliac and mesenteric lymph nodes were evaluated and scored. Immunohistochemistry did the parasite load and the MIF immunodetection technique. Granulomatous and plasmocitary inflammatory reaction predominated in the groups with clinical signs (O and S). In the S group, lymphoid atrophy predominated and was associated with high number of granulomas and high parasite load. Comparing the groups, the density of the parasites in the peripheral lymph nodes was significantly different for the S group (P<0.05). The density of the immunolabeling MIF macrophages was higher in the S group and had a significant positive correlation with the parasite load in the popliteal lymph node (P<0.05). In conclusion, the macrophages are the most involved cells, and the protozoan uses the MIF to keep the macrophage in the infection site, helping its survival in the host / Mestre