Memoria para optar el título de Bioquímico / La transcripción del DNA, primera etapa de la expresión génica, corresponde
a la conversión de un DNA molde a RNA por acción enzimática de la RNA
polimerasa (RNAP). En las células de los organismos eucariontes existen tres
clases de RNA polimerasas nucleares (RNAP I, II y III). Cada clase de RNAP
reconoce promotores específicos mediante la formación de complejos de preiniciación
(Pre-initiation Complex o PIC) entre la RNAP y el uso factores de
transcripción generales (General Transcription Factors o GTFs), siendo estos
últimos los que dan especificidad a cada PIC. Los promotores son secuencias de
DNA, normalmente ubicadas río arriba del inicio de la transcripción (Transcription
Start Site o TSS), relativamente conservadas en el genoma, que poseen todos los
elementos en cis necesarios para el inicio y la regulación de la transcripción de un
gen. Los promotores de la RNAP II son los más estudiados y se clasifican en los
que poseen caja TATA y en los que no, llamados TATA-Less. Entre los factores de
transcripción que se unen a estos promotores están TFIIB, TFIID, TFIIA, entre
otros.
La caja HomolD es un elemento del promotor mínimo que se encuentra en
un promotor de tipo TATA-less de secuencia consenso CAGTCACA, descubierto
en genes de proteínas ribosomales de Schizosaccharomyces pombe, y que es
capaz de reclutar la RNAP II e iniciar la transcripción. Estudios recientes indican
que para iniciar la transcripción desde estos promotores se necesitan los
siguientes GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH y TFIIE. Además, se ha propuesto que
el factor Rrn7 (antes conocido como miembro de la maquinaria de la RNAP I)
podría interaccionar con algunos de estos GTFs, como por ejemplo TFIIB y/o TBP
(miembro del complejo TFIID), lo que le conferiría a Rrn7 la facultad de unirse a la
caja HomolD y dirigir la transcripción. Sin embargo, aún se desconoce cuáles de
estos factores junto a Rrn7 conforman el PIC, que se ensambla sobre la caja
HomolD. En este trabajo se estudió la participación de los factores TFIIB y TBP, como
miembros candidatos del complejo de pre-iniciación formado sobre la caja
HomolD. Mediante ensayos en geles de retardo o EMSA y ensayos de
inmunoprecipitación de cromatina se analizaron las interacciones DNA-proteína y
proteína-proteína. Para realizar los ensayos de EMSA fue necesario expresar y
purificar la proteína Rrn7 recombinante utilizando una etiqueta de histidina, la que
se utilizó junto a TBP y TFIIB. Además, se purificaron anticuerpos policlonales
contra ambos factores, y fueron usados en ensayos de EMSA a modo de control.
Los resultados de los EMSA muestran una intensificación de la banda
representativa al complejo Rrn7-caja HomolD al agregar cada factor a la reacción
(TFIIB o TBP).
Los ensayos de ChIP se realizaron en una cepa silvestre de S. pombe
utilizando los mismos anticuerpos purificados contra los factores TBP y TFIIB. El
DNA obtenido, fue sometido a amplificación mediante PCR utilizando partidores
específicos para la caja HomolD. Además se realizaron dos controles, uno
utilizando partidores que amplificaron parte del promotor y del primer exón del gen
nmt1 para la caja TATA como control positivo, y otros para una región del gen de
actina (act1) como control negativo. Se observó amplificación del DNA
representativo a la caja HomolD, al precipitar cada factor, reflejando la presencia
de éstos en la región promotora.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran in vitro (EMSA) un efecto
potenciador de TBP y TFIIB sobre la formación del complejo Rrn7-caja HomolD, lo
que es complementario a la presencia mostrada in vivo (ChIP) de estos factores
en el promotor. De estos experimentos se concluye la participación de ambos
factores en la formación del complejo de pre-iniciación sobre la caja HomolD.
Además los resultados de EMSA indicaron que TFIIB posee un efecto potenciador
mayor que TBP a una determinada concentración. Por otro lado, en ensayos
EMSA ambos factores produjeron un desplazamiento o retardo de la banda del
complejo Rrn7-HomoID, pero el desplazamiento provocado por TBP fue más
intenso y estable, a diferencia del de TFIIB que fue solo temporal. Estos resultados sugieren que los roles que cumplen los factores TFIIB y TBP en el PIC en la caja
HomolD, son el de un factor reclutador de Rrn7 al promotor y el de un factor
potenciador de la interacción proteína-DNA, respectivamente / DNA transcription, the first stage of gene expression, is defined as the
conversion of a template DNA to RNA by the enzymatic action of the RNA
polymerase (RNAP). In the eukaryotic cells there are three classes of nuclear
polymerases (RNAP I, II and III). Each class of RNAP recognizes specific
promoters through the formation of pre initiation complexes (PIC) between the
polymerase and general transcription factors (GTF). The latter provide the
specificity to each PIC. These promoters are relatively conserved DNA sequences
that usually are located upstream from the transcriptional start site (TSS), and have
all the cis elements needed for the start and regulation of the transcription of a
gene. RNAP II promoters are the most studied ones, and are categorized as those
that have a TATA box or those that lack a TATA box, called TATA-less promoters.
The factors that bind to these promoters are TFIIB, TFIIA and TFIID, among others.
The HomolD box is a core promoter element (CPE) that is found in a TATAless
type promoter, whose consensus sequence is CAGTCACA. This CPE was
discovered in ribosomal protein genes of the fission yeast Schizosaccharomyces
pombe, and recruits RNAP II and starts transcription. Recent studies have shown
that to start transcription from these RNAP II promoters the GTFs: TFIID, TFIIB,
TFIIF, TFIIH and TFIIE are needed. Furthermore, it has been proposed that the
Rrn7 factor (formerly known as a member of the RNAP I machinery) interacts with
some of these GTFs, for instance with TFIIB and/or TBP (member of the TFIID
complex), which could confer Rrn7 the ability to bind the HomolD box and promote transcription. However, it is still unknown which of these factors in addition to Rrn7
conform the PIC that assembles over the HomolD box.
In this work the participation of the factors TBP and TFIIB, as candidate
members of the PIC formed over the HomolD box, was studied. Using
Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation
assays (ChIP), DNA-protein and protein-protein interactions were analyzed. To
carry out the EMSA studies, it was necessary to express and purify the
recombinant Rrn7 protein using a 6xHis tag, which was then used with the factors
TBP and TFIIB, also recombinant from S. pombe. Additionally, polyclonal
antibodies for both factors were purified and used in EMSA experiments as a
control. The EMSA results showed an intensification of the band representative of
the complex when each factor was added to the reaction (TBP or TFIIB).
ChIP assays were performed in a wild type S. pombe strain, using the same
antibodies purified for TFIIB and TBP. The DNA obtained was amplified with PCR
using specific primers for the HomolD box. Two controls were carried out, one
using primers that amplified part of the promoter and the first exon of the nmt1
gene for the TATA box as a positive control. The other control used primers for a
region of the actin gene (act1) as a negative control. When each factor was
precipitated, an amplification of the HomolD box sequence, revealing the presence
of both factors at the promoter region.
Results obtained in this work show in vitro (EMSA) an enhancer effect of
TBP and TFIIB on the formation of the Rrn7-HomolD box complex, which is
complementary to the presence shown in vivo (ChIP) of these factors in the
promoter. From these experiments it is concluded that both factors participate in
the formation of the PIC over the HomolD box. Furthermore, the EMSA results
indicate that TFIIB has a greater enhancer effect than TBP. On the other side,
EMSA assays of both factors produced a shift of the complex Rrn7-HomolD band,
but the one produced by TBP was more intense and stable, in comparison with the
complex produced by TFIIB, which was temporal and less intense. These results suggest that TFIIB recruits Rrn7 to the PIC and that TBP enhances the interaction
between protein and DNA of the PIC at the HomolD box
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/117255 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Montes Serey, Matías Ignacio |
| Contributors | Lobos Camus, Sergio, Maldonado Maldonado, Edio, Moreira Ramos, Sandra Edda, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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