THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03082004-152655 |
| Date | 13 April 2004 |
| Creators | Almeida, Juliana Dantas de |
| Contributors | Silva Filho, Marcio de Castro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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