Para estudar os mecanismos celulares que levam à mudança de cor cromomotora em crustáceos investigamos os cromatóforos ovarianos vermelhos do camarão de água doce Macrobrachium olfersi. A natureza do receptor do hormônio agregador de pigmento vermelho (RPCH) localizado na membrana plasmática é desconhecida. Muitos eventos das cascatas de sinalização induzidas por Ca2+ e GMPc, assim como os tipos de motores moleculares por elas ativados, são ainda obscuros. Avaliamos, farmacologicamente, pela perfusão in vitro dos cromatossomos com pigmentos inicialmente dispersos, possíveis funções do receptor acoplado à proteína G (GPCR), de receptores de glutamato não-NMDA (rGlu), da óxido nítrico sintase (NOS), da proteína cinase G (PKG), da cinase (MLCK) e da fosfatase (MLCP) da cadeia leve da miosina, da protéina cinase Rho (ROCK) e da miosina II não-muscular no mecanismo que induz a translocação pigmentar. Também investigamos a presença de microfilamentos de actina, microtúbulos, miosinas, cinesina e dineína, por microscopia de fluorescência. A inibição do GPCR com GDP--S (10 µM) não tem efeito significativo, mas com AntPG (5 µM) a agregação induzida por RPCH é inibida em 50%, e tem velocidade máxima de 13,3 ± 2,1 m/min (= RPCH-controle, 16,7 ± 1,6 m/min, P=0,85), seguida de dispersão espontânea. A inibição de rGlu com CNQX (50 µM) causa sutil hiperdispersão e inibe 25% da agregação induzida por RPCH, com velocidade máxima de 16 ± 1,5 µm/min (= RPCH-controle, P=0,95). A estimulação de rGlu com AMPA (30 µM) causa forte hiperdispersão (115%) e não afeta a agregação em relação ao RPCH-controle (velocidade máxima de 16,3 ± 1,8 µm/min, P=0,86). Com a inibição da NOS por L-NAME (5 mM), a agregação induzida por RPCH dura 14 min e chega aos 43,5 ± 10% de dispersão, com velocidade máxima de 11,1 ± 1,3 µm/min (= RPCH-controle, P=0,38). Com a PKG inibida por rp-sGMPc-trietilamina (3 µM), a agregação induzida por RPCH chega aos 36,2 ± 5,6% de dispersão em 12 min, com velocidade máxima de 16,9 ± 1,8 µm/min (= RPCH-controle, P=0,626), seguida de dispersão espontânea. A inibição da MLCP com cantaridina (10 µM) acelera a fase rápida da agregação induzida pelo RPCH (25,1 ± 2,6 µm/min, P= 0,017) e inibe sutilmente sua fase final (9,2 ± 5,1% após 30 min). A inibição da MLCK com ML-7 (10 µM) não afeta significativamente a agregação induzida pelo RPCH, que atinge 8,7 ± 3,14% de dispersão com velocidade máxima de 14,1 ± 1,6 µm/min (= RPCH-controle, P= 0,277). As inibições da ROCK com Y-27632 a 3 µM e H-1152 a 50 nM afetam a agregação pigmentar induzida por RPCH em 15,4 ± 4,8% e 32,8 ± 14,3%, e as velocidades máximas são similares ao RPCH-controle, de 18 ± 3,5 m/min (P=0,86) e 13,9 ± 2,3 m/min (P=0,9), respectivamente. Com H-1152 ocorre dispersão espontânea; e com ambos os compostos a dispersão durante a lavagem do RPCH é acelerada. A inibição da miosina II não-muscular com blebistatina reduz a resposta ao RPCH, havendo agregação até os 47 ± 6,2% em 16 min, com velocidade máxima de 9,1 ± 1,5 µm/min, (= RPCH-controle, P= 0,007), seguida de dispersão espontânea; a dispersão com a lavagem do RPCH ocorre normalmente. Por microscopia de fluorescência foram identificados microtúbulos, presentes nas extensões celulares com o pigmento agregado; microfilamentos de actina, aparentemente formandos trilhos aos grânulos pigmentares; miosina II não-muscular, em associação ao citoesqueleto; miosina esquelética e muscular, cinesina e dineína, em associação aos grânulos pigmentares. Evidenciamos que o receptor do RPCH pode ser do tipo GPCR. Os receptores pGlu não parecem ter papel na transdução de sinal deste neuropeptídeo. A NOS, a PKG, a MLCP e a ROCK têm papéis importante na agregação pigmentar, mas a MLCK aparentemente não. Sugerimos que o RPCH se acopla a um receptor associado à proteína G0 na membrana plasmática, e concomitantemente à elevação da concentração intracelular de Ca2+, desencadeia a ativação da NOS, que produz NO, estimulando da GC-S a liberar GMPc. Este segundo mensageiro ativa a PKG, que fosforila um sítio de ativação da miosina. O movimento da miosina é impulsionado por ciclos de fosforilação/defosforilação em um sítio regulatório de suas cadeias leves, catalizados pela MLCP e pela ROCK. Um dos tipos de miosina ativada pela PKG pode ser a miosina II não-muscular, que parece efetuar principalmente a fase lenta da agregação pigmentar. Outras miosinas e a dineína possivelmente também participam da agregação, enquanto que a cinesina parece ter papel na dispersão pigmentar. / To study the cellular mechanisms that lead to cromomotor color changes in crustaceans, we investigated the red ovarian chromatophores of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersi. The nature of the receptor for red pigment concentrating hormone (RPCH) in the plasma membrane is unknown. Many events of the induced Ca2+ and GMPc signaling cascades, as well types of molecular motors activated are still obscure. We evaluated, using pharmacological perfusions in vitro of chromatossomes with initially dispersed pigments, putative functions of a G protein coupled receptor (GPCR), non-NMDA glutamate receptors (rGlu), nitric oxide sintase (NOS), protein kinase G (PKG), myosin light chain kinase (MLCK) and phosphatase (MLCP), Rho protein kinase (ROCK) and non-muscular myosin II in the mechanism that induces pigment translocation. We also investigated by fluorescence microscopy the presence of myosins, kinesin, dinein, actin microfilaments and microtubules. GPCR inhibition with 10 µM GDP--S has no significant effect, but 5 µM PGAnt inhibits 50% of RPCH-triggered aggregation, that has maximum velocity of 13,3 ± 2,1 m/min (= RPCH-control, 16,7 ± 1,6 m/min, P=0,85), followed by spontaneous dispersion. rGlu inhibition with 50 µM CNQX causes subtle hyperdispersion and inhibits 25% RPCH induced aggregation, with a maximum velocity of 16 ± 1,5 µm/min (= RPCH-control, P=0,95). rGlu stimulation with 30 µM AMPA causes strong pigment hyperdispersion (115%) but does not affect aggregation compared to RPCH-control (16,3 ± 1,8 µm/min maximum velocity, P=0,86). NOS inhibition with 5 mM L-NAME affects RPCH-triggered aggregation, that lasts 14 min and reaches 43,5 ± 10% dispersion, with maximum velocity of 11,1 ± 1,3 µm/min (= RPCH-control, P=0,38). PKG inhibition with 3 µM rp-cGMPs-thrietylamine affects RPCH-triggered aggregation, that lasts 2 min and reaches 36,2 ± 5,6% dispersion with maximum velocity of 16,9 ± 1,8 µm/min (= RPCH-control, P=0,626), followed by spontaneous dispersion. MLCP inhibition with 10 µM cantharidin accelerates the RPCH-triggered aggregation fast phase (25,1 ± 2,6 µm/min, P= 0,017) and subtly inhibits final aggregation (9,2 ± 5,1% after 30 min). MLCK inhibition with 10 µM ML-7 does not significantly affect RPCH-induced aggregation, that reaches 8,7 ± 3,14% dispersion with a maximum velocity of 4,1 ± 1,6 µm/min (= RPCH-control, P= 0,277). ROCK inhibition with 3µM Y-27632 or 50 nM H-1152 decreases RPCH-triggered pigment aggregation by 15,4 ± 4,8% and 32,8 ± 14,3%; maximum velocities are similar to RPCH-control, 18 ± 3,5 m/min (P=0,86) and 13,9 ± 2,3 m/min (P=0,9), respectively. H-1152 induces spontaneous dispersion; dispersion during RPCH washout is accelerated by both Y-27632 and H-1152. Non-muscular myosin II inhibited with blebbistatin reduces the response to RPCH, aggregation reaching 47 ± 6,2% in 16 min, with a maximum velocity of 9,1 ± 1,5 µm/min (= RPCH-control, P= 0,007), followed by spontaneous dispersion; RPCH washout leads to normal dispersion. Microtubules are present in the cellular extensions in chromatophores with aggregated pigments; actin microfilaments, apparently form trails to associate with pigment granules; non-muscular myosin II is associated with the cytoskeleton; skeletal and muscular myosin, kinesin and dinein, associated with the granules, were revealed by fluorescence microscopy. We showed that the RPCH receptor may be a GPCR. A pGlu receptor does not seem to be present and play a role in signal transduction. NOS, PKG, MLCP and ROCK play important roles in pigment aggregation, although MLCK apparently does not. We suggest that RPCH binds to a G0 protein coupled receptor in the plasma membrane, and together with cytosolic [Ca2+] increase, triggers NOS activation, producing NO, that stimulates GC-S to release cGMP. This second messenger activates PKG, that phosphorylates an activation site on myosin, whose movements are driven by a phosphorylation/dephosphorylation cycle at a regulatory site on the myosin light chain, catalyzed by MLCP and ROCK. One of the PKG activated myosins may be non-muscular myosin II, which seems to effect mainly the slow phase of pigment aggregation. Other myosins and dinein possibly also participate in pigment aggregation, while kynesin seems to play a role in pigment dispersion.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-18122015-110129 |
| Date | 19 November 2010 |
| Creators | Sarah Ribeiro Milograna |
| Contributors | John Campbell McNamara, Marcia Maria Gentile Bitondi, Klaus Hartmann Hartfelder |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Biologia Comparada, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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