Leishmania est un parasite protozoaire eucaryote unicellulaire qui infecte plus de 1.6 millions de personnes chaque année dans plus de 98 pays. Aucun vaccin humain est actuellement disponible et peu de traitements efficaces sont utillisés pour lutter contre le large spectre de pathologies causées par Leishmania. Récemment, l’étude du contrôle de la qualité des protéines chez Leishmania infantum a révélé que DDX3, une DEAD-box hélicase à ARN dotée de multiples fonctions dans le métabolisme de l’ARN et la signalisation cellulaire, joue un rôle central dans le contrôle de qualité des protéines dans la mitochondrie. Une étude plus approfondie de ce mécanisme a révélé des interactions potentielles de DDX3 avec des composantes clés de la réponse cellulaire au stress, en particulier avec une protéine de la famille des AAA + ATPases, VCP/p97/Cdc48. Comme VCP/p97/Cdc48 participe à de multiples étapes dans le contrôle de qualité des protéines en utilisant son hydrolyse de l’ATP pour séparer les protéines ubiquitinées de leurs partenaires et les acheminer au protéasome 26S pour dégradation, nous avons émis l’hypothèse que l’homologue très conservé chez Leishmania, LiVCP, pourrait agir de la même façon. Cette étude a permis la caractérisation fonctionnelle de l’homologue VCP chez Leishmania, son rôle dans la réponse du parasite au stress et sa survie dans les macrophages, ses interactions potentielles avec d’autres partenaires dont des cofacteurs clés, ainsi que la modélisation 3D des interactions LiVCP-cofacteurs. En utilisant des mutants génétiquement générés ayant moins de copies du gène LiVCP ou des mutants dominants négatifs avec une activité VCP altérée, nous avons démontré que LiVCP est un gène essentiel et que les mutants VCP sont incapables de survivre sous le shock de la chaleur et présentent un déficit de croissance très marqué chez les amastigotes. De plus, nous avons montré une forte accumulation de protéines polyubiquitinées et une sensibilité accrue au stress protéotoxique chez ces mutants, soutenant la fonction de chaperone sélective de l'ubiquitine de LiVCP. Grâce à des analyses in silico et à la «protéomique en réseau» en utilisant des études de co-immunoprécipitation et de spectrométrie de masse (LC-MS / MS), nous avons établi le premier réseau protéique de VCP chez les parasites protozoaires et déterminé que p47, FAF2, UFD1, PUB1 et l’hétérodimère NPL4-UFD1 étaient les principaux cofacteurs de LiVCP. Enfin, nos travaux nous ont permis de faire progresser nos connaissances générales sur la protéine essentielle VCP et le contrôle de la qualité des protéines chez Leishmania et d’indiquer quelques perspectives intéressantes pour approfondir notre compréhension sur ces mécanismes importants non seulement chez Leishmania mais aussi chez d’autres trypanosomatides. / Leishmania is a unicellular eukaryotic protozoan parasite that infects over 1.6 million people each year in more than 98 countries. No human vaccine is currently available and few effective treatments are used to combat the broad spectrum of diseases caused by Leishmania. Recently, studies on Protein Quality Control in Leishmania infantum revealed that the multifunctional DEAD-box RNA helicase DDX3 involved among others in RNA metabolism and cell signaling plays a central role in mitochondrial protein quality control. Further studies revealed potential interactions of DDX3 with key components of the cellular stress response, particularly with the conserved AAA+ ATPase VCP/ p97/Cdc48. As VCP is associated with many ubiquitin-dependent cellular pathways that are central to protein quality control in other eukaryotic systems using its ATP hydrolysis to separate ubiquitinated proteins from their partners and bring them to the 26S proteasome for degradation, we hypothesized that the Leishmania highly conserved counterpart, LiVCP, might act in similar way. This study enabled the functional characterization of the Leishmania VCP homolog, its role in the parasite's response to stress and survival inside macrophages, its potential interactions with other partners including key VCP cofactors, and the homology 3D modeling of LiVCP-cofactor interactions. Using genetically engineered mutants with fewer copies of the LiVCP gene or dominant negative mutants with altered VCP activity, we demonstrated that LiVCP is an essential gene and that VCP mutants are unable to survive under heat stress and exhibit a very marked growth defect in amastigotes. In addition, we showed a high accumulation of polyubiquitinated proteins and increased susceptibility to proteotoxic stress in these mutants, supporting that LiVCP has an ubiquitin selective chaperone function. Using "network proteomics" analyses by co-immunoprecipitation and mass spectrometry (LC-MS/MS) studies, we established the first VCP protein network in protozoan parasites and determined p47, FAF2, UFD1, PUB1 and the NPL4-UFD1 heterodimer as the major cofactors of LiVCP. Overall, our work allowed us to advance general knowledge of the essential role of VCP in Leishmania protein quality control and to propose some interesting perspectives to deepen our understanding of these important pathways not only in Leishmania but also in other trypanosomatids.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/37922 |
| Date | 29 January 2020 |
| Creators | Guedes Alcoforado Aguiar, Bruno |
| Contributors | Papadopoulou, Barbara |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xv, 217 pages), application/zip, application/pdf, text/plain |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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