La relation qui lie la séquence d'une protéine à sa fonction nous échappe toujours en grande partie, pourtant elle est essentielle à la compréhension de l'évolution moléculaire.La microfluidique permet de remplacer les traditionnels tubes à essais par des micro-gouttelettes afin de tester séparément des mutants d'enzyme à des fréquences de l'ordre du kilohertz. Cette technique fournit un moyen de coupler le génotype et le produit de l'activité enzymatique (phénotype). Sélectionner et récupérer les gouttelettes sur demande et séquencer leur contenu permet d'effectuer la cartographie génotype-phénotype de millions de mutants d'enzymes en une seule expérience.Au cours de cette thèse, j'ai tout d'abord développé un système microfluidique basé sur l'expression de protéines in vitro afin de pouvoir réaliser la cartographie génotype-phénotype de Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP). Des gènes mutants de l'enzyme SGAP sont encapsulés (un par gouttelette au maximum) amplifiés, exprimés et testés contre un substrat fluorogénique. Des incompatibilités entre les étapes d'amplification, d'expression et d'essai enzymatique en gouttelettes obligent à réaliser chacune de ces étapes séparément et successivement, afin de diluer le produit de chaque réaction par l'électro-coalescence des gouttelettes. Je montre qu'un work-flow microfluidique dans lequel (i) les gènes sont encapsulés et amplifiés dans des gouttes de 0.2 pL, (ii) exprimés in vitro, (iii) testés contre un substrat fluorogenique dans des gouttelettes de 20 pL, permet de mesurer l'activité de variants de SGAP avec un contraste important. Afin d'optimiser l'essai enzymatique en gouttelettes de SGAP, j'ai aussi développé, en collaboration avec Dr. Johan Fenneteau (Laboratoire de Chimie Organique, ESPCI Paristech), un nouveau substrat fluorogénique basé sur une rhodamine hydrophile. Cette sonde est caractérisée par un échange limité de la rhodamine entre les gouttelettes.J'ai ensuite développé un work-flow microfluidique in vivo, pour Ratus norvegicus trypsin (la trypsine du rat), dans lequel les capacité de sécrétion de Bacillus subtilis sont utilisées afin de simplifier les expériences. Des cellules uniques de B. subtilis sont encapsulées dans des gouttelettes de 20 pL où elles sécrètent des mutants de la trypsine en protéine de fusion avec un rapporteur permettant de mesurer le niveau d'expression. Les mutants sont testés par électro-coalescence avec des gouttelettes de 2 pL contenant un substrat fluorogénique de la trypsine. En normalisant l'activité totale détectée par la fluorescence du rapporteur du niveau d'expression, l'efficacité catalytique peut être directement mesurée en gouttelettes. C'est la première fois qu'un système expérimental d'essai enzymatique haut-débit fournit l'opportunité de mesurer directement l’efficacité catalytique de mutants d'une enzyme à une fréquence de l'ordre du kilo Hertz. Une méthode afin de réaliser la mutagenèse saturée (tous les simples mutants) du gène de la trypsine du rat a aussi été développée. Combinée au séquençage nouvelle génération, la méthode microfluidique développée permettra de réaliser la première cartographie génotype-phénotype de tous les simples mutants de la trypsine du rat / The question of how sequence encodes proteins' function is essential to understand molecular evolution but still remains elusive.Droplet-based microfluidics allows to use micro-metric droplets as reaction vessels to separately assay enzyme variants at the kHz frequency. It also provides an elegant solution to couple the genotype with the product of the catalytic activity of enzymes. Sorting droplets on demand and sequencing their content enables to map the genotype of millions of enzyme variants to their phenotype in a single experiment.First, I developed a cell-free microfluidic work-flow to carry out genotype-phenotype mapping of Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP). Single enzyme variant genes are encapsulated and amplified in droplets, expressed, and assayed against a fluorogenic substrate. Incompatibilities between gene amplification, expression and assay reactions, constrain to execute each one of those steps successively and to dilute the product of each reaction by droplet electro-coalescence. I show that a work-flow in which (i) genes are encapsulated and amplified into 0.2 pL droplets, (ii) expressed using cell-free expression reagents in 2 pL droplets and (iii) assayed with a fluorogenic substrate in 20 pL droplets, allows to measure SGAP variants activity with high contrast. To optimize the SGAP droplet assay, I also developed in collaboration with Dr. Johan Fenneteau (Laboratory of Organic Chemistry, ESPCI Paristech), a hydrophilic rhodamine based substrate, characterized by limited exchange of the released fluorophore between droplets.Second, I developed an in vivo microfluidic work-flow on Ratus norvegicus trypsin (rat trypsin), in which Bacillus subtilis secretion abilities are used to simplify the microfluidic work-flow. Single B. subtilis cells are encapsulated in 20 pL droplets where they secrete trypsin variants as fusion proteins with a fluorescent expression-level reporter. The variants are assayed by droplet electro-coalescence with 2 pL droplets containing a trypsin fluorogenic substrate. Trypsin variants catalytic efficiency can be directly measured in droplets, by normalizing the total trypsin activity by the expression-level reporter fluorescence. This is the first time a high-throughput protein assay work-flow gives the opportunity to directly measure the catalytic efficiency of enzyme variants at the kHz frequency. A method to carry out saturated mutagenesis on the rat trypsin gene was also developed. Together with deep sequencing, the developed experimental work-flow will allow to perform the first quantitative genotype-phenotype mapping of all single point mutants of the rat trypsin protein
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017USPCC192 |
| Date | 29 September 2017 |
| Creators | Chauvin, Dany |
| Contributors | Sorbonne Paris Cité, Nizak, Clément, Griffiths, Andrew, Rivoire, Olivier |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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