Tesis de Magíster en Bioquímica Área de Especialización, Bioquímica de Proteínas y Biotecnología; y Memoria para Optar al Título de Bioquímico / Los mecanismos moleculares que permiten a Salmonella Typhimurium causar
enfermedades en mamíferos son numerosos y generan manifestaciones clínicas
que abarcan desde una colitis hasta septicemia y la posterior muerte del
hospedero. Estos mecanismos se relacionan con su capacidad de infectar en
primera instancia células epiteliales del tracto digestivo y su posterior
supervivencia y replicación en células fagocíticas. Esto es posible gracias a la
existencia de factores de virulencia que se encuentran codificados en genes
localizados mayoritariamente en islas de patogenicidad o en el plasmidio de
virulencia de Salmonella. La gran mayoría de estos mecanismos han sido
caracterizados en la infección del modelo murino o aviar. En este trabajo
buscamos identificar los genes de S. Typhimirium que están implicados en la
supervivencia de esta bacteria dentro de organismos eucariontes simples tales
como amebas. Considerando que Salmonella podría interactuar con estos
organismos en el medio ambiente, en este trabajo se usó como modelo de estudio
la ameba social Dictyostelium discoideum, que de acuerdo a nuestras
observaciones sería incapaz de degradar a Salmonella. Esto es interesante si se
toma en cuenta que las amebas presentan una estrecha relación con los
macrófagos, ya que ambas son células eucariontes que comparten muchos de los
mecanismos implicados en el proceso de fagocitosis.
Para estudiar la supervivencia de Salmonella al interior de D. discoideum
implementamos un ensayo de competencia infectando esta ameba con
S. Typhimurium 14028s y mutantes definidas. Nuestros resultados indican que las
mutantes ΔinvA y ΔssaD (relacionadas directamente con la patogenicidad de
Salmonella en otros modelos de infección) y ΔaroA (mutante metabólica),
presentan problemas de supervivencia en D. discoideum en comparación con la
cepa silvestre parental. Posteriormente, para identificar el conjunto de genes
involucrados en la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en este organismo
modelo realizamos infecciones de D. discoideum utilizando una genoteca de
~3690 mutantes de S. Typhimurium 14028s por deleción de genes individuales, que contienen un cassette de resistencia a kanamicina. Desarrollamos un
protocolo que permite amplificar y secuenciar las regiones adyacentes a la
inserción de este cassette e identificar a nivel genómico cada una de las mutantes
presentes en la población recuperada desde D. discoideum. Mediante este análisis
a gran escala fue posible identificar un total de 81 mutantes bajo selección
negativa. Entre las mutantes identificadas podemos mencionar a ΔorgB, gen que
codifica un componente esencial para el funcionamiento del sistema de secreción
tipo III (T3SS) codificado en la isla de patogenicidad SPI-1 y 3 mutantes (ΔssrA,
ΔssaR y ΔpipB2) cuya función se asocia al T3SS codificado en la isla de
patogenicidad SPI-2. El análisis a escala genómica también nos permitió tener una
idea general del ambiente en el que se encuentra S. Typhimurium al interior de
D. discoideum. Esta idea surge de la selección negativa que presentan mutantes
en genes como rpoE y creB, que codifican proteínas que participan de la
regulación transcripcional de genes asociados con la respuesta al estrés
extracitoplasmático y al crecimiento en medio mínimo, respectivamente. En
conjunto, los resultados de esta tesis constituyen un primer paso para comprender
la interacción entre Salmonella y la ameba D. discoideum a nivel molecular / The molecular mechanisms that allow Salmonella Typhimurium to cause disease
in mammals are numerous, and are responsible for clinical traits ranging from a
self-limited colitis to septicemia and eventually the death of the host. These
mechanisms are related to the ability of the pathogen to infect epithelial cells in the
small intestine and its intracellular survival and growth in phagocytic cells of the
host. This ability is the result of genes coding for virulence factors generally located
in pathogenicity islands or in the Salmonella virulence plasmid. The vast majority of
these mechanisms have been characterized using murine and avian infection
models. In this work, we aimed to identify S. Typhimurium genes involved in the
survival of this pathogen in simple eukaryotic organisms like amoebas. Considering
that Salmonella can interact with these organisms in the environment, in this work
we used the social amoeba Discoideum discoideum as a model. According to our
data, this organism is unable to degrade Salmonella after phagocytosis. This is
remarkable considering that amoebas show a close relationship with
macrophages, both being eukaryotic cells that share many phagocytosis
mechanisms.
To study the intracellular survival of Salmonella in D. discoideum we developed a
competition assay where the amoeba was infected with S. Typhimurium 14028s
and selected derivative mutants. Our data show that mutants ΔinvA and ΔssaD
(directly related to pathogenicity in other infection models) and ΔaroA (metabolic
mutant) have an impaired intracellular survival in D. discoideum as compared to
the wild-type strain. Later, in order to identify the complement of genes involved in
the intracellular survival of S. Typhimurium in this organism, we infected
D. discoideum using a single-gene deletion mutant library of S. Typhimurium
14028s (~3690 mutants), containing a kanamycin resistance cassette. We
developed a protocol to amplify and sequence the genomic region adjacent to the
resistance cassette. This protocol allowed us to identify at the genomic level the mutants present in the population of bacteria recovered from D. discoideum. Using
this genomic analysis, we identified 81 mutants under negative selection. Relevant
mutants in this group include ΔorgB, a gene that encodes an essential component
required for the function of the T3SS encoded in SPI-1, and 3 mutants (ΔssrA,
ΔssaR and ΔpipB2) in genes associated to the T3SS encoded in SPI-2.
Furthermore, our genomic analysis allowed us to have a general idea of the
environment faced by Salmonella within D. discoideum. This notion comes from
the negative selection observed for mutants in genes such as rpoE and creB,
coding proteins involved in the transcriptional regulation of genes associated to
extracitoplasmatic stress and growth in minimal media, respectively. Taken
together, the results in this work are the first step in the understanding of the
molecular mechanisms involved in the interaction between Salmonella and
D. discoideum / Conicyt; Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/150153 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Riquelme Barrios, Sebastián Andrés |
| Contributors | Santiviago Cid, Carlos, Chávez Espinosa, Francisco |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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