Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease. Esta toxicidade envolve a liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) da proteína, por ação hidrólitica de catepsinas encontradas no sistema digestivo de insetos suscetíveis. Baseado na sequência N-terminal do pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente (jaburetox-2Ec) foi clonado, a partir da sequência da JBURE-II, e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo recombinante Jaburetox-2Ec (carregando epítopo V5 e cauda His) foi testado contra os insetos Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda e 100% de mortalidade foi observado em todos os modelos após a ingestão de microgramas do peptídeo. Outros dados mostram que jaburetox-2Ec tem capacidade de interagir com bicamadas lipídicas acídicas, permeabilizando lipossomas, além de atividade antifúngica. Estudos de modelagem do peptídeo revelaram a presença de um grampo beta, que poderia estar envolvido nesta toxicidade. A fim de estudar os motivos envolvidos nestas atividades biológicas, escolhemos uma abordagem de mutagênese dirigida. Para isto, a sequência de DNA do jaburetox foi clonado em plasmídeo pET-23a, obtendo-se a expressão do jaburetox, contendo apenas cauda de histidina, e a partir deste, obtivemos diferentes mutantes: 1) deleção de todo o grampo beta (aminoácidos 61-75); 2) deleção da metade N-terminal do peptídeo, que corresponde a uma região ausente nas ureases bacterianas; 3) deleção da metade C-terminal do peptídeo. Ensaios de formação de canais iônicos em bicamadas lipídicas artificiais com o jaburetox e mutantes mostraram que todos formam canais iônicos, ainda que com diferentes características. Bioensaios com o percevejo Oncopeltus fasciatus (injeção na hemocele) e leveduras mostraram que a região do grampo-beta não está envolvida nos efeitos do peptídeo nesses organismos, sendo que é a região Nterminal responsável pelas atividades inseticida e antifúngica do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, that are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms in plants. Our group described the insecticidal activity of canatoxin, an isoform of urease. This toxicity involves the release of an internal peptide of 10 kDa (pepcanatox), released by the hydrolytic action of cathepsins found in the susceptible insects gut. Based on the N-terminal sequence of pepcanatox, a corresponding fragment of 270 bp (jaburetox-2Ec) was cloned from the JBURE-II and expressed in Escherichia coli. This recombinant peptide Jaburetox-2Ec (carrying the V5 epitope and His tag) was tested against the insect Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Spodoptera frugiperda, and 100% mortality was observed in all the models after ingestion of micrograms of the peptide. Other data showed that Jaburetox-2Ec has the ability to interact with acidic lipid bilayers, liposomes leakage and also antifungal activity. Molecular modeling studies of the peptide revealed the presence of a β-hairpin motif, which could be involved in this toxicity. In order to identify structures involved in the biological activities, we chose a directed mutagenesis approach. For this, the jaburetox cDNA was cloned into pET-23a vector (to yield the expression of jaburetox containing only histidine tag), and from this, we obtained different mutants: 1) deletion of the entire β- hairpin motif (amino acids 61 -75); 2) deletion of the N-terminal half of the peptide, which corresponds to a region absent in bacterial ureases; 3) deletion of the C-terminal half of the peptide. Planar lipid bilayers experiments were performed with jaburetox and all mutants, and we observed channels activity in all cases. Bioassays with Oncopeltus fasciatus and Rhodnius prolixus showed that the region of β-hairpin is not involved in the effects of the peptide in these organisms, and the N-terminal region of the Jbtx carries the most important entomotoxic domain which is fully active in the absence of the β-hairpin motif.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.lume.ufrgs.br:10183/90481 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Martinelli, Anne Helene Souza |
| Contributors | Carlini, Celia Regina Ribeiro da Silva, Pasquali, Giancarlo, Schwartz, Jean-Louis |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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