Einleitung: Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) stellen das hauptsächliche Energiesubstrat für Wiederkäuer dar. In Anbetracht des - bedingt durch höhere Milch-, Mast und Reproduktionsleistung - steigenden Energiebedarfs von Hauswiederkäuern wie Milchkuh und Mastbulle ist es von zentraler Bedeutung, die Mechanismen zur Resorption dieser Energielieferanten bzw. Ansatzpunkte für die Beeinflussung dieser Transportprozesse genau zu kennen. Dieses Wissen kann möglicherweise dabei helfen, zukünftig die Energieaufnahme der Tiere zu unterstützen bzw. sogar effizienter zu gestalten.
Ziele der Untersuchungen: Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die Mechanismen zur Resorption von SCFA zu charakterisieren, wobei der Schwerpunkt auf den Transport aus den Pansenepithelzellen ins Blut gelegt wurde, da hierzu im Gegensatz zu ihrer Aufnahme aus dem Pansenlumen in die Epithelzellen noch sehr wenig bekannt war. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, inwiefern die nachgewiesenen Mechanismen einer Regulation unterliegen und über welche Signalwege diese vermittelt werden könnte.
Materialien und Methoden: Zur Charakterisierung der beteiligten Resorptionsmechanismen wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack von Schafen in Ussing-Kammern eingespannt und mit Hilfe radioaktiv markierten Azetats, Butyrats und L-Laktats der Transport dieser Substrate unter verschiedenen Bedingungen sowie verschiedenen Hemmstoffeinflüssen untersucht. Zur Charakterisierung regulativer Einflüsse wurden die Epithelstücke über sechs bzw. 24 Stunden mit Butyrat inkubiert und anschließend RNA bzw. Totalprotein extrahiert. Hiermit konnten Veränderungen in mRNA- und Proteinexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Western Blot nachgewiesen werden.
Ergebnisse: Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels hauptsächlich proteinvermittelt erfolgt. Eine signifikante Beteiligung lipophiler Diffusion, d.h. ein passiver Transport, kann weitgehend ausgeschlossen werden. Der aktive Transport wies eine bikarbonatabhängige und eine bikarbonatunabhängige Komponente auf. Der Einsatz von Hemmstoffen verschiedener Transportproteine ergab deutliche Hinweise darauf, dass der Monocarboxylattransporter (MCT) 1 eine Rolle beim bikarbonatgekoppelten Transport von Azetat bzw. allgemein unmetabolisierten SCFA spielt. Diese Hinweise wurden untersetzt durch die Beobachtung, dass MCT 1, aber auch der apikal bzw. intrazellulär lokalisierte MCT 4 durch langfristige Inkubation des Epithels mit Butyrat sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene signifikant erhöht exprimiert wurden, was als Anpassungsreaktion an eine Substratakkumulation interpretiert werden kann. Außerdem wurde auch die mRNA-Expression des Putativen Anionentransporters (PAT) 1 durch Inkubation mit Butyrat erhöht, was für eine Beteiligung auch dieses Transportproteins am SCFA-Transport über das Pansenepithel spricht. Allerdings ist im Gegensatz zu MCT 1 die Lokalisation des PAT 1 in der basolateralen Membran noch fraglich. Die Expressionssteigerung von Zielgenen des Nukleären Faktors ĸB und des Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptors α sowie des Hypoxie-induzierbaren Faktors selbst deuten weiterhin darauf hin, dass die Steigerung der Transportkapazitäten von MCT 1 und 4 und auch PAT 1 über diese Signalwege vermittelt wird.
Schlussfolgerungen: Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels näher charakterisiert werden, sodass es nun möglich ist, zusammen mit den bereits vorliegenden Befunden für die apikale Membran ein komplettes Modell dafür zu erstellen. Auch wurden Erkenntnisse zu regulativen Einflüssen auf diesen Transport gewonnen, die es zukünftig ermöglichen könnten, die Resorption der SCFA aus dem Pansen nutritiv oder eventuell pharmakologisch zu beeinflussen.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für Wiederkäuer 3
2.2 Metabolismus von SCFA im Pansenepithel 4
2.2.1 Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten vom Pansenlumen ins Epithel 4
2.2.2 Produktion von HCO3- aus CO2 durch die Carboanhydrase 5
2.2.3 Bereitstellung von Energie für die Epithelzellen 5
2.2.4 Bereitstellung von wasserlöslichen, glukosesparenden Energiesubstraten für die periphere Zirkulation 5
2.2.5 Verhinderung möglicher Schädigungen durch Butyrat 6
2.3 Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren 7
2.3.1 Para- versus transzelluläre Resorption 7
2.3.2 Transzelluläre Resorption mittels lipophiler Diffusion 7
2.3.3 Proteinvermittelte SCFA-Permeation 9
2.3.4 Permeation von SCFA aus dem Epithel ins Blut 11
2.4 Beeinflussung der SCFA-Resorption auf Genexpressionsebene 17
2.4.1 Beeinflussung der Genexpression durch Butyrat 17
2.4.2 Beeinflussung der Genexpression durch Hypoxie 20
2.4.3 Mechanismen für die Regulation der Genexpression durch Butyrat
(-Metaboliten) und Hypoxie 21
2.5 Fragestellungen dieser Arbeit 26
3 Ergebnisse 28
3.1 Publikation 1 28
3.2 Publikation 2 41
4 Diskussion 54
4.1 Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels 54
4.1.1 Transport mittels lipophiler Diffusion 57
4.1.2 SCFA werden bevorzugt über die basolaterale Membran transportiert 58
4.1.3 SCFA(-Metaboliten) werden bikarbonatabhängig über die basolaterale Membran transportiert 59
4.1.4 SCFA(-Metaboliten) werden durch einen Anionenaustauschmechanismus ins Blut ausgeschleust 61
4.1.5 Azetat wird durch einen pHMB- und CHC-sensitiven Mechanismus
transportiert 63
4.2 Der Transport von SCFA über das Pansenepithel unterliegt regulativen
Einflüssen 68
4.2.1 Einfluss von Butyrat(-Metaboliten) auf die Expression von potentiellen SCFA Transportern 68
4.2.2 Mechanismen für die Regulation der Expression durch Butyrat(-Metaboliten) 72
4.3 Theoretisches Modell des SCFA-Transports und dessen Regulation auf Genexpressionsebene auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit 74
5 Zusammenfassung 76
6 Summary 78
7 Literaturverzeichnis 80
Danksagung 98 / Introduction: The main energy source for ruminants are short chain fatty acids (SCFA). Considering the ever increasing energy requirements of cattle due to increasing milk yield and meat production, it is crucial to identify the mechanisms for the resorption of these energy sources as well as possibilities to influence these transport mechanisms. This knowledge could help support the animals’ energy uptake or even making it more efficient.
Aim: Thus, the aim of the present study was to characterise mechanisms for the resorption of SCFA focusing on their transport from the epithelial cells into the blood. In particular, since – compared to the research findings on the uptake of SCFA from ruminal lumen into the cells – so far only very little was known regarding this side of the epithelium. In a second step, the study aimed to elucidate whether the mechanisms observed are subject to regulatory processes and which signalling pathways are involved.
Materials and methods: To characterise the transport mechanisms involved, epithelial pieces from the ventral sac of ovine rumen were mounted in Ussing chambers. Using radioactively labelled acetate, butyrate and L-lactate, the transport of these substrates was investigated under different conditions and by applying different inhibitors for potential SCFA transport proteins. To characterise regulatory influences, epithelial pieces were incubated with butyrate for six and 24 hours, respectively. Subsequently, total RNA and protein were extracted to detect changes in mRNA and protein expression using quantitative real time PCR and western blot, respectively.
Results: The present study could show that transport of SCFA across the basolateral membrane of rumen epithelium is mainly realised by protein-mediated mechanisms. A significant participation of lipophilic diffusion, i.e. a passive transport, can almost entirely be excluded. The active transport could be divided into a bicarbonate-dependent and a bicarbonate-independent part. The experiments with inhibitors of different transport proteins showed clear evidence of an involvement of monocarboxylate transporter (MCT) 1 in the bicarbonate-dependent transport of acetate and non-metabolised SCFA in general. This evidence was supported by the finding that the expression of MCT 1 but also of the apically and intracellularly localised MCT 4 was increased significantly on both mRNA- and protein-level after long-term incubation of the epithelium with butyrate. This can be interpreted as an adaptation to a substrate accumulation. Additionally, butyrate incubation led to an increased mRNA expression of putative anion transporter (PAT) 1, which makes an involvement of this transport protein in SCFA transport across ruminal epithelium likely as well. However, in contrast to MCT 1 the localisation of PAT 1 in the basolateral membrane is still questionable. The increased expression of target genes of nuclear factor ĸB and peroxisome-proliferator activated receptor α as well as of hypoxia inducible factor strongly point to an involvement of these pathways in the increased expression of MCT 1 and 4 as well as PAT 1.
Conclusions: In summary, this study could characterise the transport of SCFA across the basolateral membrane of ruminal epithelium in detail for the first time. This enables us to draw a complete model of ruminal SCFA transport. Also, evidence for regulatory influence on this transport processes was found, perhaps making it possible to influence resorption of SCFA from rumen by nutritive or pharmacological means in the future.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für Wiederkäuer 3
2.2 Metabolismus von SCFA im Pansenepithel 4
2.2.1 Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten vom Pansenlumen ins Epithel 4
2.2.2 Produktion von HCO3- aus CO2 durch die Carboanhydrase 5
2.2.3 Bereitstellung von Energie für die Epithelzellen 5
2.2.4 Bereitstellung von wasserlöslichen, glukosesparenden Energiesubstraten für die periphere Zirkulation 5
2.2.5 Verhinderung möglicher Schädigungen durch Butyrat 6
2.3 Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren 7
2.3.1 Para- versus transzelluläre Resorption 7
2.3.2 Transzelluläre Resorption mittels lipophiler Diffusion 7
2.3.3 Proteinvermittelte SCFA-Permeation 9
2.3.4 Permeation von SCFA aus dem Epithel ins Blut 11
2.4 Beeinflussung der SCFA-Resorption auf Genexpressionsebene 17
2.4.1 Beeinflussung der Genexpression durch Butyrat 17
2.4.2 Beeinflussung der Genexpression durch Hypoxie 20
2.4.3 Mechanismen für die Regulation der Genexpression durch Butyrat
(-Metaboliten) und Hypoxie 21
2.5 Fragestellungen dieser Arbeit 26
3 Ergebnisse 28
3.1 Publikation 1 28
3.2 Publikation 2 41
4 Diskussion 54
4.1 Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels 54
4.1.1 Transport mittels lipophiler Diffusion 57
4.1.2 SCFA werden bevorzugt über die basolaterale Membran transportiert 58
4.1.3 SCFA(-Metaboliten) werden bikarbonatabhängig über die basolaterale Membran transportiert 59
4.1.4 SCFA(-Metaboliten) werden durch einen Anionenaustauschmechanismus ins Blut ausgeschleust 61
4.1.5 Azetat wird durch einen pHMB- und CHC-sensitiven Mechanismus
transportiert 63
4.2 Der Transport von SCFA über das Pansenepithel unterliegt regulativen
Einflüssen 68
4.2.1 Einfluss von Butyrat(-Metaboliten) auf die Expression von potentiellen SCFA Transportern 68
4.2.2 Mechanismen für die Regulation der Expression durch Butyrat(-Metaboliten) 72
4.3 Theoretisches Modell des SCFA-Transports und dessen Regulation auf Genexpressionsebene auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit 74
5 Zusammenfassung 76
6 Summary 78
7 Literaturverzeichnis 80
Danksagung 98
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:13147 |
| Date | 09 December 2014 |
| Creators | Dengler, Franziska |
| Contributors | Gäbel, Gotthold, Breves, Gerhard, Veterinär-Physiologisches Institut |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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