Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (vFHCC), l'agent étiologique causant la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (FHCC), est répandu à travers l'Afrique, l'Europe et l'Asie. La FHCC présente un taux de mortalité pouvant atteindre jusqu'à 30% et est considérée comme une infection virale émergente ou ré-émergente de haut niveau de surveillance internationale. Chez l'humain, le virus se transmet par des piqûres de tiques du genre Hyalomma sp infectées ainsi que par contact avec des fluides corporels d'animaux et humains infectés. À l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin approuvé par les principaux organismes de réglementation contre le vFHCC ni son vecteur, la tique. À cet effet, des vaccins à base d'ADN pourraient être utilisés afin d'induire les réponses immunitaires cellulaire et humorale, une technologie qui permettrait la fabrication et le déploiement flexible de vaccins en situation de pandémie. Dans la présente étude, la conception et le développement de nouveaux plasmides d'ADN, appelés plasmides pour l'administration intradermique de vaccins (pIDV, de l'anglais plasmids for intradermal delivery of vaccines) ont été optimisés pour l'expression dans les cellules eucaryotes en incorporant des éléments génétiques réutilisés d'autres plasmides bien caractérisés. Le clonage de l'élément PRE Woodchuck dans un plasmide pIDV-II a amélioré l'expression d'un transgène de protéine fluorescente verte (GFP), comparativement aux plasmides « parents » pVax et pCAGGS, d'où sa sélection pour les tests d'immunisation ultérieurs. Il a été démontré que le plasmide pIDV-II convient à la vaccination animale et qu'il augmente l'antigénicité chez la souris contre des glycoprotéines-cibles du virus Ebola, du VIH et du vFHCC, en comparaison avec le plasmide d'ADN pVax1, une technologie plus standard. Plus précisément, deux gènes précurseurs de glycoprotéines (GPC) des souches Turkey04 et Turkey-Keltit06 du vFHCC, dont la sélection des codons a été optimisée, ont été clonés pour former les plasmides pIDV-II-GPC-Tky-04 et pIDV-II-GPC-Kelkit06. Seule la construction comprenant la séquence GPC Turkey04 a été retenue pour les tests d'immunogénicité en raison de sa capacité à générer des simili-virus ou VLP, de l'anglais virus-like particles, dans un système de minigénome rapporteur. Ce plasmide a permis d'augmenter la réponse immunitaire cellulaire, mesurée par la liaison des IgG sériques aux VLP de vFHCC et la production d'interféron-gamma dans les splénocytes murins stimulés par peptides analogues. La réponse immunitaire chez des moutons injectés avec le plasmide pIDV-II-GPC-Tky04 par voie intradermique avec un appareil à tatouer IONAID (Intradermal Oscillatory Needle-Acquired Device), développé à l'interne, s'est montrée supérieure à la réponse immunitaire induite par électroporation. Cette étude a aussi examiné le potentiel immunogène des différents antigènes de tiques lorsqu'insérés dans pIDV-II. L'ADN codant pour l'antigène HA86 de la glycoprotéine a été sélectionné, car le gène est très similaire au seul vaccin anti-tiques de type Bm86 à avoir été commercialisé. L'antigène de tique 64P et le peptide pP0 ont été sélectionnés pour leur potentiel d'application comme éléments vaccinaux contre d'autres espèces de tiques. Le peptide pP0 a été employé pour fusionner les gènes HA86 et 64P. Des recherches antérieures suggèrent que le peptide immunostimulant 5mer4 encodé dans un fragment d'ADN puisse agir comme un adjuvant simple et efficace pour améliorer la réponse immunitaire chez des souris vaccinées. Ainsi, ce peptide a été retenu pour créer des antigènes de tiques ayant des propriétés adjuvantes encodés dans l'ADN plasmidique. Afin d'évaluer les IgG totaux chez la souris, un plasmide pIDV-II-10HIS a été généré afin d'exprimer et de purifier in vitro des antigènes recombinants de tiques. Néanmoins, seulement les constructions d'ADN basées sur le gène HA86 ont pu induire une réponse humorale chez la souris. Ce travail de thèse a également révélé que la séquence d'ADN du peptide 5mer4 fusionnée aux antigènes de tiques, encodés dans l'ADN, augmentait la liaison des IgG totaux aux antigènes HA86 chez des souris vaccinées. Dans l'ensemble, l'étude présentée ici décrit le développement d'un vaccin à ADN contre le vFHCC, qui pourrait être utilisé à l'avenir en conjonction avec un vaccin à ADN anti-tiques pour stimuler la reconnaissance immunitaire d'antigènes basés sur HA86 ciblant les tiques du genre Hyalomma sp dans un but de prévenir la transmission du vFHCC chez l'humain et les animaux. Cette stratégie s'avère très prometteuse pour la protection contre d'autres vecteurs et pathogènes causant la maladie de Lyme, la Dengue et le Zika. / Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV), the etiologic agent of Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF), has a wide presence in Africa, Europe, and Asia. CCHF is associated with a mortality rate of up to 30% and is considered an emergent or re-emergent virus of global concern due to its continuing spread. In humans, the virus is transmitted by infected Hyalomma sp ticks as well as from contact with body fluids from infected animals through transient viremia and nosocomial transmission. Currently, there are no clinical or veterinary vaccines approved by major regulatory agencies against CCHFV or the tick vector. DNA-based vaccine technology can be used to induce cellular and humoral immune responses and allows for manufacturing and flexible deployment of vaccines in pandemic scenarios. In this study, the design and development of novel DNA plasmids for intradermal delivery of vaccines (pIDVs) were first generated and optimized for eukaryotic expression using repurposed genetic elements from well-characterized plasmids. The cloning of a known Woodchuck post-translational regulatory element (PRE) in a pIDV-II plasmid improved transgene expression of a cloned green fluorescent protein similarly compared to a cloned version of the parent plasmids pVax and pCAGGS, and was chosen for subsequent immunization assays. The pIDV-II plasmid was demonstrated to be suitable for animal immunization and improved antigenicity in mice against glycoproteins from EBOV, HIV, and CCHFV targets, which differed in their molecular complexity, compared to the standard pVax1 DNA plasmid technology. Specifically, two codon-optimized glycoprotein precursor (GPC) CCHFV genes from Turkey04 and Turkey-Keltit06 strains, two clinically related isolates, were cloned to create pIDV-II-GPC-Tky-04 and pIDV-II-GPC-Kelkit06 plasmids. Only the construct bearing the GPC sequence Turkey04 was selected for immunogenicity assays due to its capacity to generate CCHF virus-like particles (CCHFV-VLPs) in a Biosafety Level 2 surrogate minigenome reporter system. This plasmid improved the humoral and adaptive cell-mediated immune responses as assessed by serum IgG binding to CCHFV-VLPs and production of interferon-gamma by peptide-stimulated mice splenocytes, respectively. The immune response to pIDV-II-GPC-Tky04 in sheep delivered by intradermal oscillatory needle-acquired injection device (IONAID) tattooing technology made in-house was more robust than the immune response to an electroporation-assisted procedure. This study also examined concealed and exposed tick antigens that were tested as pIDV-II vaccines to potentially control tick infestation in animals. The "concealed" DNA-encoded HA86 antigen truncated glycoprotein was selected since the gene is closely related to the only commercially successful Bm86-like anti-tick vaccine; furthermore, its recombinant form has shown efficacy in decreasing the survival of Hyalomma ticks in vaccinated calves. The exposed 64P tick antigen and pP0 peptide were also selected for this study based on previous research suggesting broader applicability of these factors to tick species other than the original isolate. The pP0 peptide was used to fuse the HA86 and 64P genes. Previous research suggests that the use of the DNA-encoded immune peptide 5mer4 as an effective adjuvant with a simple composition enhances the immune response of vaccinated mice; thus, this peptide was used to create adjuvant DNA-encoded tick immunogens. For proper evaluation of total IgG responses in mice, a pIDV-II-10HIS plasmid was created to transiently express and purify in-vitro recombinant tick antigens. Generally, in this study, after a single immunization, only HA86-based DNA constructs were able induce humoral responses in mice. This thesis work also determined that using the peptide 5mer4 fused to DNA-encoded tick antigens efficiently enhanced total IgG binding to HA86 antigens in groups of vaccinated mice. Overall, the study presented here describes the development of CCHFV DNA-based vaccine, which can be combined with a DNA-based anti-tick vaccine and recombinant proteins for immune detection of HA86-based antigens targeting ticks of the genus Hyalomma sp. to prevent CCHFV spread in animals and humans in the future. This strategy offers great promise for protecting against other pathogens and their vectors, such as Borrelia sp, ticks, and mosquitoes that cause diseases including Lyme disease, Zika, and Dengue.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/70319 |
| Date | 27 January 2024 |
| Creators | Echanove Juan, Jose Arquimides |
| Contributors | Kobinger, Gary, Sato, Sachiko |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xvii, 187 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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