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Previous issue date: 2011 / The genus Angiostrongylus Kamensky, 1905 belongs to the Phylum Nematode, with round shape as its main feature. Two species have medical importance, A. costaricensis living in mesenteric arteries of wild mice and causing abdominal angiostrongyliasis in human and A. cantonensis which lives in pulmonary arteries of rats and may cause eosinophilic meningoencephalitis in humans. The diagnosis of both diseases is difficult due to absence of parasite in feces in case of the infection by A. costaricensis and seldom detected larvae in the cerebrospinal fluid in case of eosinophilic meningoencephalitis. Several studies have been performed to improve the diagnosis of angiostrongyliasis which should be able to differentiate in a specific and sensitive way among other parasitic infections. The 31kDa antigen has been considered the main antigen for eosinophilic meningoencephalitis diagnosis due to A. cantonensis infection. However this antigen is obtained from crude extracts of the worm by a laborious process of purification with low yielding and insufficient amount for large distribution to other diagnostic centers. In order to improve the serologic diagnostic of angiostrongyliasis and make the antigens widely available the present work aimed to identify new antigenic targets and also characterize the 31kDa antigen for further recombinant production. Besides that, essential molecules for parasite survival were investigated which in the future may be targets for disease treatment. Two sources of antigen from female worms were used: excretion and secretion products (ES) and total extract (TE). In ES, sample antioxidant enzymes activity were detected such as catalase and superoxide dismutase. Also was identified by Western blot and Mass spectrometry (MS), 17 proteins target for disease diagnosis and treatment like hemoglobinases, heat shock proteins and proteases inhibitors. In TE sample antioxidant enzymes as well as glutathione transferases (GST) which is another kind of defense enzyme were also detected. GSTs were purified by affinity chromatography and analyzed by MS. Peptide sequences from this experiment matched with homologous sequences of sigma class GST. In TE samples was possible to characterize the 31kDa and after two-dimensional electrophoresis was shown to be composed of four spots around 4. 5 of isoelectric point (pI) and being recognized by sera from patients infected with Angiostrongylus spp. The spots were analyzed by MS and three different proteins were identified: 14-3-3 protein, NAC domain containing protein, and epsilon subunit of the coatomer protein complex isoform 2. The 31kDa antigen was characterized as a glycoprotein through studies of oxidation of carbohydrate where it was observed that the antigenicity of four spots was dependent on sugar residues. The DNA sequences of the antigens were obtained by random sequencing of the genome for 454 platform (Roche) and deposited in Genbank. The data generated in this study contribute significantly to the development of recombinant antigens that may be widely distributed for independent diagnostic validation. / O gênero Angiostrongylus Kamensky, 1905 agrupa animais pertencentes ao filo Nematoda, cuja característica marcante é a forma corporal cilíndrica. Duas espécies possuem importância médica: A. costaricensis cujo habitat natural são as artérias mesentéricas de camundongos silvestres e na infecção humana pode levar ao desenvolvimento de angiostrongilíase abdominal; e A. cantonensis que habita as artérias pulmonares de roedores e na infecção humana pode causar meningoencefalite eosinofílica. O diagnóstico de ambas as doenças é dificultado pela ausência de formas parasitárias nas fezes, no caso de infecções por A. costaricensis e raramente encontradas no líquido cefaloraquidiano no caso de meningoencefalite eosinofílica. Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos para o aprimoramento da detecção das angiostrongilíases visando testes que sejam capazes de discernir das diferentes infecções parasitárias de forma sensível e específica. O antígeno de 31kDa é considerado atualmente o principal antígeno para o diagnóstico da meningoencefalite eosinofílica, causada por A. cantonensis, entretanto é proveniente da purificação de extratos brutos do parasito o que acarreta num processo laborioso e dispendioso que em última análise gera quantidades insuficientes para que haja ampla distribuição e compartilhamento entre os centros de diagnóstico. Com o intuito de aprimorar o diagnóstico sorológico das angiostrongilíases e tornar os antígenos disponíveis globalmente o presente trabalho buscou identificar novos alvos antigênicos e caracterizar o antígeno de 31kDa para posterior propagação de formas recombinantes. Além disso, foram estudadas moléculas que podem ser fundamentais na manutenção do parasitismo, que futuramente poderão ser alvos para o tratamento das angiostrongilíases. Duas fontes de antígenos a partir de vermes adultos fêmeas foram empregadas: produtos de excreção e secreção (ES) e extrato bruto (TE). Nos ES foi detectada a atividade de enzimas antioxidantes como catalase e superóxido dismutase e identificadas, por western blot e espectrometria de massas (MS), 17 proteínas alvo para o diagnóstico e tratamento das angiostrongilíases dentre elas hemoglobinases, proteínas de choque térmico e inibidores de proteases. Nas amostras de TE além da identificação de enzimas antioxidantes, estavam presentes glutationas transferases (GST), outra classe de enzimas de defesa. Estas proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e analisadas por MS o que revelou sequencias peptídicas homólogas a GST de classe sigma. Em TE também foi possível a caracterização do antígeno de 31kDa que quando submetido a eletroforese bidimensional mostrou-se ser composto por 4 spots com ponto isoelétrico (pI) em torno de 4,5 sendo reconhecidos pelo soro de pacientes infectados com Angiostrongylus spp. Os spots foram analisados por MS e três diferentes proteínas foram identificadas: 14-3-3; proteína com domínio NAC e a subunidade épsilon do coatamero. O antígeno de 31kDa foi caracterizado como uma glicoproteína através de estudos de oxidação de glicídeos, onde se observou que a antigenicidade dos 4 spots foi dependente de resíduos de açúcar. As sequências de DNA dos antígenos foram obtidas pelo sequenciamento aleatório do genoma pela plataforma 454 (Roche) e depositadas no Genbank. Os dados gerados no presente trabalho contribuem de forma significativa para o desenvolvimento de antígenos recombinantes que poderão ser amplamente distribuídos para validação e aplicação em diagnóstico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_PUC_RS:oai:meriva.pucrs.br:10923/5350 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Morassutti, Alessandra Loureiro |
| Contributors | Graeff-Teixeira, Carlos |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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