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Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Os vírus entéricos eliminados pelas fezes de indivíduos infectados se dispersam nos ambientes aquáticos por meio do lançamento de esgoto. Dentre esses vírus os norovírus (NoV) são atualmente considerados a principal causa de surtos de gastrenterite mundialmente, decorrentes da ingestão de água e alimentos contaminados, como também estão associados a hospitalizações. O objetivo dessa pesquisa foi detectar e caracterizar parcialmente os NoV humanos (genogrupos I e II) em diferentes tipos de água e esgoto bruto da Região Metropolitana de Belém. O estudo envolveu águas superficiais de baía (Ver-o-Peso), rio (Porto do Açaí), igarapé (Tucunduba) e dois mananciais (Bolonha e Água Preta), como também água tratada (ETA-Bolonha) e esgoto bruto (EEE-UNA), coletadas mensalmente ao longo de dois anos. Essas águas e esgoto (2 litros) foram inicialmente concentradas em membranas filtrantes obtendo-se um volume final de 2mL. O ácido nucléico foi extraído pelo método da sílica e submetido à reação de semi nested RT-PCR (reação em cadeia mediada pela Polimerase precedida de transcrição reversa) utilizando iniciadores específicos para NoV GI e GII. O cDNA obtido após transcrição reversa foi utilizado para pesquisa de GI/GII também por TaqMan® PCR em tempo real. As amostras positivas por ambas as metodologias moleculares foram analisadas para a região 5’-terminal da ORF2 por nested (GI) e semi nested (GII) com o intuito de obter amplicon para identificação das cepas circulantes, sendo posteriormente purificados com uso de kit comercial e submetidos a caracterização molecular em sequenciador automático. As sequências obtidas foram editadas, alinhadas e comparadas com outras depositadas no banco de genes (GenBank - NCBI) e no site NoV genotyping tool. No período de novembro de 2008 a outubro de 2010, 168 amostras de água e esgoto foram coletadas e analisadas quanto a presença de NoV, obtendo-se positividade de 33,9% (57/168), das quais 21,1% (12/57) foram positivas somente por TaqMan® PCR em tempo real, 19,3% (11/57) por semi nested e 59,6% (34/57) por ambas. Considerando as duas metodologias utilizadas, nos casos positivos, GI (82,5% -47/57) foi mais frequente do que GII (79,0% - 45/57). Porém, na maioria das amostras houve coexistência dos dois genogrupos (61,4% - 35/57), principalmente nas amostras do igarapé Tucunduba e EEE-UNA, considerados os locais mais contaminados por NoV. Por outro lado, na ETA-Bolonha esse agente não foi encontrado. Das 57 amostras positivas por TaqMan® PCR em tempo real e/ou semi nested RT-PCR, 53 foram retestadas para a região 5’-terminal da ORF2, uma vez que quatro apresentaram quantidade insuficiente de material que permitisse uma nova análise, assim em 47,2% (25/53) o genoma de NoV foi detectado, das quais 12% (3/25) pertenciam ao GI, 24% (6/25) ao GII e 64% (16/25) para ambos. Os genótipos mais frequentes de GI e GII foram respectivamente GI.8 (n=8) e GII.4 (n=12), porém outros genótipos foram observados com menor incidência como GII.6 (n=3), GII.9 (n=2), GII.12 (n=1), GII.14 (n=1), GI.1 (n=1) e GI.4 (n=2). Devido a baixa qualidade das sequências obtidas oito amostras não puderam ser genotipadas para GI e três para GII. Das 96 amostras com concentração de coliformes termotolerantes acima do recomendado, 34 (35,4%) também foram positivas para NoV. Aumento na condutividade e sólidos totais dissolvidos foi observado nos materiais do Ver-o-Peso e igarapé Tucunduba, assim como a turbidez foi nitidamente mais elevada nesses locais e no Porto do Açaí. No período menos chuvoso (julho a novembro) houve uma tendência no aumento da positividade para NoV, e nos meses de maior pluviosidade (dezembro a junho) notou-se um decréscimo na incidência desse agente. Os resultados obtidos no presente estudo apontam a circulação de NoV GI e GII nos ambientes aquáticos de Belém, revelando a degradação que estes corpos hídricos vêm sofrendo como consequência da precariedade ou ausência de saneamento na nossa cidade, permitindo a permanência nesses ecossistemas, juntamente com seus efluentes, de patógenos causadores de doenças. / Enteric viruses excreted in feces from infected individuals dispersed in aquatic environments by sewage discharge. Among these viruses, the norovirus (NoV) is actually considered the main cause of gastroenteritis outbreaks worldwide, resulting from the ingestion of contaminated food and water as well as is also associated with hospitalizations. This research aimed to detect and partially characterize the human NoV (GI/GII) in different water matrices and in untreated sewage from Metropolitan Region of Belem. The study involved superficial waters from bay (Ver-o-Peso), river (Acai’s Port), stream (Tucunduba) and two lakes (Bolonha and Agua Preta), as well as treated water (WTP-Bolonha) and untreated sewage (SLP-UNA), monthly collected over two years . The water and sewage (2 liters) were initially concentrated on filtering membranes to obtain a final volume of 2 mL. The nucleic acid was extracted by silica method and submitted to semi nested RT-PCR (reverse transcription Polymerase chain reaction) using NoV GI and GII specific primers. The cDNA obtained after reverse transcription was also used to investigate the GI/GII by TaqMan® real time PCR. The positive samples for both molecular methods were analyzed for 5’end ORF2 by nested (for GI) and semi nested (for GII) in order to obtain amplicon for identification of circulating strains, being further purified using a commercial kit and submitted to molecular characterization in the automated sequencer. The obtained sequences were edited, aligned and compared to others available in gene bank (NCBI) and in the site NoV genotyping tool. In the period of November 2008 to October 2010, 168 water and sewage samples were collected and analyzed for NoV presence, obtaining a positivity of 33.9% (57/168) of which 21.1% (12/57) were positive only by TaqMan® real time PCR, 19.3% (11/57) only by semi nested and 59.6% (34/57) for both. Considering the two methodologies used, in the positive cases GI (82.5% - 47/57) was most frequent than GII (79.0% - 45/57). However, in most samples there was coexistence of the two genogroups (61.4% - 35/57), mainly in the Tucunduba and SLP-UNA samples, considered the most NoV contaminated sites. On the other hand, in WTP-Bolonha this agent was not found. Of 57 positive samples by TaqMan® real time PCR and/or semi nested RT-PCR, 53 were retested for 5’end ORF2, since four samples showed insufficient quantity of material which allowed a new analyze, so, in 47.2% (25/53) the NoV genome was detected, of these 12% (3/25) belonging to GI, 24% (6/25) to GII and 64% (16/25) for both. The most frequent GI and GII genotypes were GI.8 (n=8) and GII.4 (n=12), respectively, but others genotypes were also observed with lower incidence as GII.6 (n=3), GII.9 (n=2), GII.12 (n=1), GII.14 (n=1), GI.1 (n=1) and GI.4 (n=2). Due to low quality of sequences obtained, eight samples could not be genotyped for GI and three for GII. Of 96 samples with concentration of thermotolerant coliforms above the recommended, 34 (35.4%) were also NoV positive. Increase on conductivity and total dissolved solids was observed in materials from Ver-o-Peso and Tucunduba, as well as the turbidity was notably higher in these places and the Acai’s Port. In the less rainy period (July to November) there was a trend in positivity increasing for NoV, and in the highest rainfall (December to June) a decrease in the incidence of this agent was noted. The results obtained in the present study indicate the circulation of NoV GI and GII in aquatic environments in Belem, revealing the degradation that these water bodies have suffered, as a result of poverty or lack of sanitation in our city, allowing the permanence of pathogens in these ecosystems, along with its effluents.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpa.br:2011/9204 |
| Date | January 2014 |
| Creators | TEIXEIRA, Dielle Monteiro |
| Contributors | GABBAY, Yvone Benchimol |
| Publisher | Universidade Federal do Pará, Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais, UFPA, Brasil, Núcleo de Medicina Tropical |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPA, instname:Universidade Federal do Pará, instacron:UFPA |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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