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Previous issue date: 2010-02-25 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The possibility of using a practical, fast and effective protocol for embryo cryopreservation such as glazing, may stimulate the application of the technique associated with embryo transfer by a larger number of teams at field level. However, it is necessary to develop specific protocols that result in increased embryonic viability. The objective of this study was to identify the damage caused by cryopreservation, assessing the morphological and ultrastructural feasibility of goat and sheep embryos undergoing cryopreservation of classic and vi trification in OPS (Open Pulled Straw). In experiment 1, embryos (N = 246) were obtained from superovulated Boer goats. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 75) - freezing the classic method, DMSO group (n = 74) - vitrification and Group DF (n = 74) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO +0.5 sucrose. The embryos ofthe third group were placed in a balanced so lution containing 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. In experiment 2, sheep embryos (N = 186) were obtained from superovulated Santa Ines ewes. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 55) - freezing the classic method, DMSO group (n = 54) - vitrification and Group DF (n = 55) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO+0.5 sucrose. The embryos of group three were placed in a balanced solution containin g 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. The embryos were evaluated by analysis of embryonic viability by the use of fluorescent probes, in this case propidium iodide and Hoechst 33342 Results indicate that in goat embryos, the control group maintained most of its viable cells after thawing with 33 33% of samples injured. Of embryos in the DMSO group, 26.66% had totally damaged cells. The DF group had 60% of samples with lesions. The ultrastructural study by transmission electron microscopy showed that the vitrified embryos had a greater preservation of cells. The vitrified embryos with DMSO had higher rates of in vitro survival (47.36%), followd by embryos glazed with the DF with a lower in vitro survival rate (31.58%), and lastly embryos frozen by the traditional method (25%). In sheep embryos found in theanalysis by fluorescent probe, cells in t he control group remained viable in all embryos analyzed, a similar result occurred with the DF group, where 80% of samples were deemed feasible, other than the DMSO group, which had 50% viability. The ultrastructural study showed that the findings were similar between the control and DF groups. Embryos vitrified with DF had higher rates of in vitro survival (53.33%) and in vivo (45%), the glazed with DMSO had an in vitro survival rate (26.66%) and in vivo (30%) and embryos frozen by the traditional method (33.33%) in vitro and (40%) in vivo. It can be concluded that the vitrification solution containing 20% ethylene glycol + 20% dimethylsulfoxide + 0.5 M sucrose is an effective method for cryopreservation of goat embryos produced in vivo. However, in sheep embryos, the combination of 20% ethylene glycol + 20% dimethylformamide + 0.5 M sucrose was the best cryoprotectant regarding embryo viability, demonstrating to cause less damage to thecytoskeleton and cell organelles, and presenting a satisfactory pregnancy rate. / A possibilidade de utilizar um protocolo de criopreservação prático, rápido e eficaz, como a vitrificação, estimularia a aplicação da técnica associada à transferência de embriões por um maior número de equipes em nível de campo. Porém, faz-se necessário o desenvolvimento de protocolos específicos que resultem no incremento da viabilidade embrionária. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação, avaliando a viabilidade morfológica e ultra-estrutural de embriões caprinos e ovinos submetidos a criopreservação pelo método clássico e pela vitrificação em OPS (Open Pulled Straw). No experimento 1, os embriões (N=246) foram obtidos de cabras da raça Boer superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 75) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n= 74) – vitrificação e Grupo DF(n= 74) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando nasolução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20%DMSO +0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. No experimento 2, os embriões ovinos (N=186) foram obtidos de ovelhas da raça Santa Inês superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 55) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n=54) – vitrificação e Grupo DF (n= 55) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando na solução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DMSO+0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados emsolução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. Os embriões foram avaliados por meio da análise da viabilidade embrionária pelo uso de sondas fluorescentes, utilizou-se Iodeto de Propídeo e Hoechst 33342, verificou-se nos embriões caprinos, que o grupo controle mantiveram grande parte das suas células integras após o descongelamento, 33,33% das amostras apresentaram-se lesionadas. Os embriões do grupo DMSO analisados, 26,66% estavam com suas células totalmente danificadas. O grupo DF apresentou 60% das amostras com lesões. O estudo ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que os embriões vitrificados revelaram uma maior preservação das células. Os embriões vitrificados com DMSO tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (47,36%), os vitrificados com DF tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (31,58%), os congelados pelo métodoclássico obtiveram in vitro (25%). Nos embriões ovinos verificamos na análise por sonda fluorescente, que as células do grupo controle mantiveram viáveis em todos os embriões analisados, resultado semelhante ocorreu com o grupo DF, onde 80% das amostram foram consideradas viáveis, diferente do grupo DMSO, que tiveram 50% de viabilidade. O estudo ultra-estrutural demonstrou que os achados foram semelhantes entre os grupos controle e DF. Os embriões vitrificados com DF tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (53,33%) e in vivo (45%), os vitrificados com DMSO tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (26,66%) e in vivo (30%) e os congelados pelo método clássico obtiveram (33,33%) in vitro e (40%) in vivo. Podemos concluir que, a solução de vitrificação contendo 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilsulfóxido + 0,5M sacarose é um método eficiente para a vitrificação de embriões caprinosproduzidos in vivo. Entretanto em embriões ovinos, a associação de 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilformamida + 0,5M de sacarose, foi o crioprotetor que apresentou melhor viabilidade embrionária, demonstrando causar menos lesões ao citoesqueleto e as organelas celulares, como isso apresentando um índice de gestação satisfatório.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/5804 |
| Date | 25 February 2010 |
| Creators | LEMOS, Paula Fernanda Barbosa de Araújo |
| Contributors | OLIVEIRA, Marcos Antonio Lemos de, FREITAS, Vicente José de Figueirêdo, LIMA, Paulo Fernandes de, CHIAMENTI, Adauto, GUIDO, Sebastião Inocêncio |
| Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária, UFRPE, Brasil, Departamento de Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -3061482854177903105, 600, 600, 600, 600, -3020210563763616780, 453670264235017319, -2555911436985713659 |
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