Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid und ZIKV-Kapsid selbst geeignete Biomarker für den Nachweis einer ZIKV-Infektion sind. Sie kann damit als erste Phase einer Studie zur Entwicklung neuer ZIKV-Diagnostika angesehen werden. Der Aufbau, das klinische Erscheinungsbild, die Epidemiologie und der Nachweis von ZIKV, bzw. einer ZIKV-Infektion, wurden erörtert. Die Möglichkeiten und Limitationen aktueller ZIKV-Diagnostika wurden beschrieben, insbesondere hinsichtlich der Spezifität. Durch Analyse des Genoms von ZIKV und anderen Flaviviren wurde gezeigt, dass die Aminoäuresequenzidentität zwischen den einzelnen Flaviviren für flavivirales Kapsid geringer ist als für andere Bestandteile und potenzielle Antigene von Flaviviren. Relevant ist insbesondere die Abgrenzung zu DENV, da eine akute oder abgelaufene DENV-Infektion eine häufige Ursache von Kreuzreaktivität beim Nachweis einer ZIKV-Infektion darstellt. Mittels webserverbasierten In-silico-Analysen konnten immunogene Regionen innerhalb des ZIKV-Kapsid-Proteins kartiert und mit den immunogenen Regionen, welche für ZIKV-Kapsid anderer Flaviviren In-silico oder experimentell ermittelt wurden, verglichen werden. Auf Basis dieser Analysen war die Erwartung, dass bei einer ZIKV-Infektion humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gebildet werden, welche sich in ihren Paratopen von Antikörpern, die gegen Kapsid-Proteine anderer Flaviviren gebildet werden, unterscheiden. Der Umfang der humanen Antikörperantwort auf ZIKV-Kapsid wurde in dieser Arbeit anschließend untersucht. Dazu wurde das Antigen ZIKV-Kapsid eines ZIKV-Stamms aus der afrikanischen Linie (hier: Stamm MR766) rekombinant hergestellt. Rekombinantes ZIKV-Kapsid eines Stammes der asiatischen Linie (hier: Stamm Z1106033) wurde erworben. In 11 humanen Seren und einem Pool-Serum (WHO-Referenzserum) wurde versucht Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper mittels ELISAs und Western Blots nachzuweisen. Es fanden sich keine bis schwache Hinweise auf das Vorhandensein von Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern in diesen Seren. Im direkten Vergleich mit 10 Seren von ZIKV-negativen Blutspendern zeigten sich für die Seren des ZIKV-Serumpanels keine höheren ELISA-Extinktionswerte. Dies galt sowohl für den Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der afrikanischen Linie als auch beim Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der asiatischen Linie. Im Sinn der Ermittlung der Paralleltestreliabilität fand sich für Anti-ZIKV-Kapsid-IgG in einer Regressionsanalyse ein schwacher linearer Zusammenhang zu Messwerten eines gut validierten Referenztests, dem ZIKV-NS1-ELISA der Firma Euroimmun. Dies ist ein schwacher Hinweis auf die postinfektiöse Bildung von humanen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern. Obwohl der lineare Zusammenhang signifikant war, ist die Aussagekraft dieses Ergebnisses eingeschränkt. Es fanden sich Hinweise auf unspezifische, im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig identifizierte, Einflüsse auf die Testergebnisse der eigenen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs. Es ist vorstellbar, dass der gefundene lineare Zusammenhang zum Referenztest teilweise durch diese unspezifischen Einflüsse, im Sinn von Kovariablen, verursacht wird. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs zeigten Hinweise für falsch-positive Messergebnisse bei der Testung von fünf DENV-positiven Seren.
Mit Hilfe von Western Blots, welche verglichen mit ELISAs als spezifischer gelten, konnten in Seren des ZIKV-Serumpanels keine ZIKV-Kapsid-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Auch Antikörper aus Seren von ZIKV-negativen Blutspendern und IgG-Antikörper aus gereinigten IgG-Antikörper-Lösungen verursachten positive und somit unspezifische Testergebnisse (Banden). Eine mögliche Erklärung dafür liegt in der hohen Hydrophobizität von ZIKV-Kapsid, was für die Anlagerung nichtspezifischer humaner Antikörper sorgen könnte.
Es ist möglich diese Arbeit in zwei Teile zu unterteilen, wobei sich der erste Teil vor allem dem Nachweis von humanen Antikörpern gegen ZIKV-Kapsid widmet und der Nachweis von ZIKV-Kapsid in Serum von Infizierten den zweiten Teil darstellt. Für den Nachweis des Antigens wurden polyklonale und monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch Immunisierung von Mäusen mit ZIKV-Kapsid und anschließendem Einsatz der Hybridomtechnik konnten durch Dr. Sven Reiche (Friedrich-Löffler-Institut) und Prof. Christian Jassoy vier monoklonale Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gewonnen werden. Diese Antikörper wurden in dieser Arbeit weiter charakterisiert. Sie zeigten sich als geeignet und spezifisch beim Nachweis von ZIKV-infizierten Vero-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbungen. Durch Kompetitionstests hatte sich zuvor bereits gezeigt, dass alle Antikörper an dasselbe, oder mindestens nahe beieinander liegende Epitope binden. Da sie sich somit bei Einsatz in einem Sandwich-ELISA zum Nachweis von ZIKV-Kapsid als Antigen verdrängen würden, wurden zwei polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper erworben. Ein Sandwich-ELISA, der polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Fängerantikörper und monoklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Detektionsantikörper nutzt, konnte erfolgreich zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in verschiedenen Lösungen, u. a. nativem ZIKV-Kapsid in Zellkulturüberstand, eingesetzt werden. Der so aufgebaute Antigen-ELISA erreichte, abhängig von der Kombination an Antikörper und Antigen, eine untere Nachweisgrenze zwischen 2 bis 345 ng/ml. Um zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in humanem Serum eines ZIKV-infizierten Patienten eingesetzt werden zu können, müsste seine Sensitivität um etwa zwei bis drei Logstufen steigen. Möglichkeiten dazu wurden diskutiert.:1 Inhaltsverzeichnis 2
2 Abkürzungsverzeichnis 7
3 Einführung 10
4 Aufgabenstellung 47
5 Materialien und Methoden 49
6 Ergebnisse 97
7 Diskussion 131
8 Zusammenfassung 156
9 Literaturverzeichnis 158
10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 182
11 Anlagen 187
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:78229 |
| Date | 01 March 2022 |
| Creators | Wenzel, Robert |
| Contributors | Ulbert, Sebastian, Henschler, Reinhard, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/updatedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0025 seconds