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Imagerie du collagène par microscopie multiphotonique.

Le développement de nouveaux outils et de nouvelles techniques pour la biologie et la médecine a toujours été un moteur pour la recherche en microscopie. Les premiers microscopes permirent à Antoine Von Leeuwenhoek en 1677 de découvrir les bactéries, les spermatozoïdes et les globules rouges et aujourd'hui nous cherchons à visualiser les processus intracellulaires, l'interaction des protéines, l'interaction des cellules dans les tissus... Chaque année de nouvelles techniques apparaissent pour voir plus petit, plus spécifique, plus physiologique. Le laboratoire d'optique et biosciences dans lequel j'ai effectué ma thèse s'intéresse plus particulièrement aux techniques de microscopie multiphoton. Ce type de microscopie, qui re- pose sur les interactions non linéaires entre la matière et la lumière, est principalement utilisé aujourd'hui pour suivre des marqueurs fluorescents dans les tissus grâce au processus de fluo- rescence sous excitation à deux photons. En cela, elle sert à suppléer la microscopie confocale pour visualiser des phénomènes à des profondeurs de pénétration qui lui sont inaccessibles, et permet ainsi de travailler sur l'ensemble d'un tissu. Toutefois, la microscopie multiphoton ne se borne pas à la fluorescence sous excitation à 2 photons ; elle donne aussi accès à des processus non linéaires comme la génération d'harmoniques ou l'émission Raman anti-Stockes stimulée. Ces interactions non linéaires sont encore peu utilisées en biologie et font l'objet de recherches dans notre laboratoire. L'un des processus non linéaires étudiés au laboratoire est la génération de second harmo- nique (SHG). Celle-ci a été mise en évidence en 1961 par P. A. Franken[1] dans des cristaux non linéaires et s'utilise couramment pour doubler la fréquence des lasers. En 1979, ce proces- sus a été appliqué en biologie par Samuel Roth et Isaac Freund[2] sur des tendons de rat où l'organisation du collagène permet d'obtenir l'effet non linéaire. Presque trente années se sont écoulées depuis cette expérience, mais la génération de second harmonique par le collagène reste mal comprise. De plus, même si de nombreuses études ont montré le potentiel de cette technique, elle reste peu utilisée par les biologistes. Cette thèse, sous la direction de Marie-Claire Schanne-Klein, veut répondre à plusieur questions : - Quel est le rôle de l'organisation submicrométrique du collagène dans la génération du signal de second harmonique ? - Que peut apporter cette technique dans la visualisation du collagène par rapport aux autres techniques déjà existantes ? - Quelle est la pertinence de cette technique pour répondre à des problématiques biolo gique ? Nous nous sommes focalisés sur la fibrose qui est une accumulation anormale de collagèn dans les tissus. Une thèse précédente réalisée dans notre laboratoire par Ana-Maria Pena avai déjà montré le potentiel de la génération de second harmonique pour évaluer la gravité d fibroses pulmonaires induites par la bléomycine. Toutefois, ces études réalisées en collabora tion avec le service de pneumologie de l'hôpital Bichat sont restées à l'état de démonstration de principe. Nous avons alors engagé une collaboration étroite avec une équipe de néphro logues composée de Pierre Louis Tharaux, Monica Hernest et Cécile Fligny (Cardiovascula Research Center Inserm Lariboisière INSERM U689, France) qui travaillent sur les phéno mènes de fibroses dans le rein, et nous avons appliqué la microscopie par génération de second harmonique à cette problématique biomédicale. Dans ce manuscrit, le premier chapitre introduit les notions biologiques sur le collagèn et la fibrose nécessaires à la compréhension de la suite. Le deuxième chapitre présente le diverses techniques de visualisation du collagène, insiste sur les principes et le dispositif d microscopie multiphoton et enfin développe une modélisation du signal de génération de se cond harmonique par le collagène observé en microscopie. Nous proposons ensuite dans l troisième chapitre une méthodologie pour quantifier la fibrose rénale, que nous validons su un modèle murin de fibrose rénale. Enfin, le dernier chapitre est consacré à l'application d notre méthodologie à diverses problématiques biologiques liées à la fibrose rénale.

Identiferoai:union.ndltd.org:CCSD/oai:pastel.archives-ouvertes.fr:pastel-00004540
Date27 November 2008
CreatorsStrupler, Mathias
PublisherEcole Polytechnique X
Source SetsCCSD theses-EN-ligne, France
LanguageFrench
Detected LanguageFrench
TypePhD thesis

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