Ziel dieser Doktorarbeit war es, eine Verbesserung der Herstellung und Kultivierung von Rho0-Zelllinien zu erreichen.
Die bisher notwendige Uridin-Supplementierung sollte durch eine Modifizierung des Zellstoffwechsels, insbesondere der De-novo-Synthese von Pyrimidinen, ersetzt werden. Die membranständige, ubiquinonabhängige Dihydroorotat-Dehydrogenase (DHODH) der Säugetiere wurde durch eine zytsolische DHODH der Hefe S. cerevisiae, die Fumarat als Elektronenakzeptor besitzt, ersetzt.
Dazu wurden zunächst mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) das URA-1-Gen der DHODH aus der genomischen DNA von S. cerevisiae amplifiziert. Anschließend wurde das Gen als Insert in den pCR-II-TOPO-Vektor kloniert und vervielfältigt. Dieses Plasmid diente als Ausgangspunkt für die Herstellung verschiedener anderer Vektoren: pDHODH-IRES2-EGFP und pDHODH-IRES2-EGFP-LXRN.
Mit Hilfe des Vektors pDHODH-IRES2-EGFP wurden 0 -Zellen der Linie 143B.TK- Rho0 Klon 7 transfiziert und die eingebrachte DHODH auf eventuelle Nebeneffekte, wie z.B. Toxizität für die Kulturzellen, überprüft.
Der retrovirale Vektor pDHODH-IRES2-EGFP-LXRN wurde zur Transfektion einer verpackenden Zelllinie, RetroPack TM PT 67, und damit zur Retrovirenproduktion benutzt. Mit den so hergestellten Retroviren wurden dann Zellen der Linie 143B.TK- Rho0 infiziert und die zytosolische DHODH stabil in ihre genomische DNA integriert. Nach dieser Veränderung wurden die Zellen metabolischen Tests unterzogen: Kultivierung in Medium ohne Uridin-Supplementierung, mit Pyruvat-Supplementierung und Kultivierung in uridin- und pyruvat-freiem Medium. Die infizierten Zellen überlebten in uridinfreiem Medium, die Pyruvat-Abhängigkeit blieb allerdings erhalten.
Den Zellen wurde also ein neuer atmungsketten-unabhängiger Weg zur Nukleotidsynthese ermöglicht.
Im Anschluss an diese Versuche mussten die Kulturzellen noch retrospektiv analysiert werden, um den endgültigen Beweis zu erbringen, dass sie immer noch im Rho0-Zustand waren und die zytosolische DHODH aus S. cerevisiae wirklich enthielten. Zu diesem Zweck wurde die genomische DNA aus den Kulturzellen isoliert und anschließend mittels PCR analysiert. Zur Kontrolle der DHODH-Produktion der Zellen wurde eine RT-PCR angefertigt.
Die Kontrolluntersuchungen bestätigten die Ergebnisse der metabolischen Tests.
Metabolische Tests, sowie die DNA- und RNA-Analysen zeigen, dass die zytosolische DHODH aus S. cerevisiae mit Hilfe des Retrovirusvektors in das Genom von Rho0-Zellen eingebracht wurde, von dort abgelesen wird und das synthetisierte Enzym funktionsfähig und in genügend großer Menge in der Zielzelle vorhanden ist.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:12212 |
| Date | 07 December 2018 |
| Creators | Strauß, Jessica |
| Contributors | Fuhrmann, Herbert, Seibel, Peter, Weishaupt, Andreas, Universität Leipzig, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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