Das fetale Atemnotsyndrom ist eine der häufigsten Erkrankungen des Frühgeborenen. Zur Erweiterung und Verbesserung der aktuellen Therapieoptionen ist ein Verständnis der pathophysiologischen Ursachen der Krankheitsentstehung fundamental. Es ist bereits bekannt, dass epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zwischen Fibroblasten und Pneumozyten eine wesentliche Rolle bei der Steuerung der fetalen Lungenreife einnehmen. Die von den Fibroblasten sezernierten Faktoren haben gestationsalterabhängig eine unterschiedliche Zusammensetzung und Funktion, welche zum Verständnis des fetalen Atemnotsyndroms von besonderem Interesse sind. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Neuregulin-1β als potentiellen Bestandteil der von Fibroblasten sezernierten Faktoren näher untersucht. Hierzu wurde ein auf Fibroblasten inkubiertes Medium hergestellt, welches die sezernierten Faktoren enthält und anschließend zur Inkubation der fetalen Lungenepithelzellen genutzt wurde. Die Wirkung dieses Mediums konnte daraufhin mit der des Neuregulin-1β verglichen werden. Bezüglich der Lungenproliferation und der Surfactantproteinexpression und -sekretion ist bereits eine fördernde Wirkung von Fibroblasten konditioniertem Medium und Neuregulin-1β bekannt. Bezüglich der Kapazität des Lungenepithels zur Flüssigkeitssekretion bzw. -resorption spielen allerdings besonders die epitheliale Ionenkanalexpression und -aktivität eine Rolle. Diese wurden bisher nur unzureichend untersucht. Laut dem klassischen Modell der fetalen Lungenentwicklung geht man von einer im Laufe der Gestation wechselnden Ausprägung verschiedener Ionenkanäle aus. Fetal überwiegen demnach vor allem CFTR-Kanäle, welche eine vorwiegende Sekretion von Alveolarflüssigkeit bedingen. Perinatal treten epitheliale Natriumkanäle in den Vordergrund und gehen mit einer steigenden Resorptionskapazität des Epithels bis zur Geburt einher. Diesbezügliche Wechselwirkungen stellen im Zusammenhang zur perinatalen Umstellung auf die Atmung entscheidende Faktoren für die postnatale Adaption und die spätere Lungenfunktion dar. Somit wurde vor allem der Einfluss von Neuregulin-1β auf den epithelialen Ionentransport der Typ-II-Pneumozyten in den Mittelpunkt der Untersuchungen gestellt. Zu Beginn wurden die folgenden Fragestellungen erarbeitet:
• Welchen Einfluss hat Fibroblasten-konditioniertes Medium auf die Ionenkanalexpression und aktivität der fetalen Typ-II-Pneumozyten?
• Kann eine Inkubation mit Neuregulin-1β die Effekte des Fibroblasten-konditionierten Mediums imitieren?
• Begünstigen Fibroblasten-konditioniertes Medium und Neuregulin-1β die Reifung fetaler Typ II-Pneumozyten?
• Unterscheiden sich kurzzeitige von langzeitigen Effekten des Neuregulin-1β?
• Werden die Effekte des Fibroblasten-konditionierten Mediums über den ErbB2-Rezeptor vermittelt, welcher ebenfalls an der Signaltransduktion von Neuregulin-1β in anderen Geweben beteiligt ist?
Fetale distale Lungenepithelzellen der Ratte wurden als Monolayer-Zellkulturen mit verschiedenen Medien inkubiert. Ionenkanalaktivität und Konfluenz der Epithelien wurden anschließend mittels elektrophysiologischer Messung in der Ussing-Kammer untersucht. Die Genexpression wurde mittels quantitativer Real-Time PCR erfasst. Unter verschiedenen Versuchsbedingungen konnten die Einflüsse von Fibroblasten-konditioniertem Medium und Neuregulin-1β verglichen werden. In Anlehnung an bisher veröffentlichte Ergebnisse wurde ein Schwerpunkt auf den epithelialen Natriumkanal sowie den CFTR-Kanal gelegt. Der Effekt wurde nach Kurzzeit- (2 h) und Langzeitinkubation (48 h) verglichen. Außerdem fand ein Ausschluss von Einflüssen des serumhaltigen Inkubationsmediums auf die Wirkung des Neuregulin 1β statt. Zuletzt wurde durch die Inhibition des ErbB2-Rezeptors mit dem spezifischen kompetitiven Inhibitor AG-825 ein möglicher Signalweg der Effekte des Fibroblasten-konditionierten Mediums untersucht.
Die Inkubation der fetalen Alveolarzellen mit Fibroblasten-konditioniertem Medium führte zu einer Aktivitätssteigerung des CFTR-Kanals. Diese konnte durch Inkubation mit Neuregulin 1β reproduziert werden. Der epitheliale Natriumkanal wird durch Fibroblasten-konditioniertes Medium positiv, durch Neuregulin-1β negativ reguliert. Die ermittelten Unterschiede der Ionenkanalaktivität wurden vorrangig über eine veränderte Genexpression umgesetzt. Die Steigerung der CFTR Kanalaktivität durch Fibroblasten-konditioniertes Medium konnte auf eine Vermittlung über den ErbB2-Rezeptor zurückgeführt werden. Dieser Rezeptor ist auch an diversen Signaltransduktionskaskaden des Neuregulin-1β beteiligt. Es liegt also nahe, dass Neuregulin 1β als möglicher Bestandteil des Fibroblasten-konditionierten Mediums, die Steigerung der CFTR Kanalaktivität über den ErbB2-Rezeptor vermittelt. Auch der Nachweis von intrinsisch von fetalen Alveolarzellen produziertem Neuregulin-1β deutet darauf hin, dass Neuregulin 1β möglicherweise im Fibroblasten-konditionierten Medium enthalten ist. Ebenso konnte nach Inkubation der Alveolarzellen mit Fibroblasten-konditionierten Medium eine Verminderung der Expression von intrinsisch produziertem Neuregulin-1β beobachtet werden. Im Sinne einer negativen Feedbackregulation könnte das im Fibroblasten-konditionierten Medium enthaltene Neuregulin-1β zur Verringerung der epitheleigenen Produktion dieses Mediators führen. Bei zweistündiger Inkubation mit Neuregulin-1β war keine Änderung der Ionenkanalaktivität zu beobachten. Die Wirkung von Neuregulin-1β wird also hauptsächlich über genomisch regulierte Prozesse umgesetzt. In weiteren Versuchen zeigte sich kein Einfluss von Neuregulin-1β auf die Konfluenz der Epithelien. Eine Steigerung der CFTR Kanalaktivität bedingt die Förderung der Sekretionskapazität des Alveolarepithels. Fibroblasten konditioniertes Medium und Neuregulin-1β wirken somit proliferationsfördernd auf die fetale Lunge. Indirekt könnte auch die Differenzierung zu reifen Pneumozyten begünstigt werden, da diese nur nach ungestörter Proliferationsphase zu einer voll funktionsfähigen Lunge führt. Darüber hinaus unterstreichen Erkenntnisse neuerer Veröffentlichungen eine Beteiligung des CFTR-Kanals an der perinatalen Differenzierung und Flüssigkeitsresorption der Lunge. Womöglich hat Neuregulin-1β also auch differenzierungsfördernde Eigenschaften. Diese müssten in weiteren Versuchen spezifiziert werden.
Nachdem die entwicklungsfördernden Effekte des Fibroblasten-konditionierten Mediums in dieser Arbeit bestätigt werden konnten, lag der Schwerpunkt auf der Wirkung des Neuregulin-1β. Der Mediator wird intrinsisch von den Pneumozyten der Lunge sezerniert und ist in der Lage, einen Teil des entwicklungsfördernden Effektes des Fibroblasten-konditionierten Mediums zu imitieren. Hierbei handelt es sich um eine Steigerung der CFTR-Kanalaktivität, welche die Proliferation fetaler Pneumozyten durch vermehrte Sekretion von Alveolarflüssigkeit begünstigt. Neuregulin-1β stellt mit höchster Wahrscheinlichkeit einen Bestandteil des Fibroblasten-konditionierten Mediums dar. Zum genaueren Verständnis der Rolle des Neuregulin-1β müssten weitere Versuche angeschlossen werden. So steht auch der Nachweis des Mediators im Fibroblasten-konditionierten Medium aus. Neben der Untersuchung des Mediators Neuregulin-1β bleibt aber besonders die Entschlüsselung der von den Fibroblasten der Lunge sezernierten Faktoren interessant. Deren Kenntnis würde einen Durchbruch im Verständnis der pathophysiologischen Ursachen des fetalen Atemnotsyndroms darstellen und eine Grundlage zur Findung neuer Therapiemöglichkeiten dieses Krankheitsbildes bieten.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:32782 |
| Date | 24 January 2019 |
| Creators | Wenzel, Fine |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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