Belastungsinduzierte Sehnen- und Bandschäden, besonders die der
Oberflächlichen Beugesehne, sind eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen bei Sportpferden. Die intraläsionale Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine vielversprechende Therapieoption zur Reduktion der Rezidivraten dar. Der Verbleib der applizierten Zellen und ihre Wirkungsmechanismen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die Magnetresonanztomografie (MRT) ist ein hervorragendes Werkzeug
zur Erkennung von Sehnengewebsabnormalitäten im distalen Gliedmaßenbereich sowie zum Verfolgen injizierter Zellen. Mit superparamagnetischen Eisenoxid-Partikeln (Spio) markierte MSC werden in der MRT als hypointense Artefakte sichtbar. Gesunde Sehnen zeigen jedoch auch ein hypointenses Signal, wodurch es nicht möglich ist, markierte Zellen von physiologischem Sehnengewebe zu unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war die magnetresonanztomografische Darstellung Spio-markierter equiner MSC in unterschiedlichen Zellzahlen in equinem physiologischen Sehnengewebe mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes.
In der vorliegenden Arbeit wurden equine MSC mit Spio-Partikeln
(BioPal Molday ION Rhodamine B, Inc., Worcester, USA) markiert und in präparierte Schnittinzisionen, in zuvor entnommenen Oberflächlichen Beugesehnen von Kadaverbeinen,in unterschiedlichen Zellzahlen von 106, 105, 104 MSC injiziert. Anschließend erfolgte eine magnetresonanztomografische Untersuchung der Sehnenkonstrukte jeweils in einem 90° sowie 55° Winkel zum Hauptmagnetfeld B0 in drei Magnetresonanztomografen unterschiedlicher Feldstärken (0,27 T (Tesla), 3 T, 7 T). Dabei wurden jeweils T1- und T2*-
gewichtete 3D-Gradientenechosequenzen genutzt. Im Anschluss erfolgte eine histologische Validierung der magnetresonanztomografischen Ergebnisse mittels Preußischblau-, Diamino-2-Phenylindol-Färbung (DAPI) und Hämatoxylin-Eosin-Färbung.
Im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T konnte eine signifikante Zunahme der
Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes (Konstruktwinkelung von 55° zum Hauptmagnetfeld B0) im Vergleich zur 90° Standardwinkelung verzeichnet werden (p < 0,05). Des Weiteren konnte die Ausprägung des Magic-Angle-Effektes im 3 T-Hochfeldsystem in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz als deutlicher beurteilt werden als im Niederfeldsystem (p < 0,05). Im 7 THochfeldsystem
konnten keine signifikanten Unterschiede der Signalintensität der
Oberflächlichen Beugesehne in den unterschiedlichen Sequenzen und Winkelungen der Sehnenkonstrukte zum Hauptmagnetfeld B0 gefunden werden. Die Detektion einer Zellzahl von 106 markierten MSC war sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem und sowohl in der T1- als auch in der T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes sicher möglich (p < 0,05). Darüber hinaus konnte im Hochfeld-MRT 7 T ebenfalls eine Zellzahl von
104 markierten MSC visuell detektiert werden. Des Weiteren konnte im Nieder- sowie 3 THochfeldsystem bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein höheres Kontrast-Rausch-Verhältnis der T1-gewichteten Sequenzen beider Winkeltechniken gegenüber der T2*-gewichteten Sequenzen festgestellt werden. Darüber hinaus stellte sich das Kontrast-Rausch-Verhältnis
beider Sequenzen mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes höher gegenüber der
Standardwinkelung von 90° zum Hauptmagnetfeld B0 dar. Außerdem konnte mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein erhöhtes Kontrast-Rausch-Verhältnis in den T1- und T2*-gewichteten Sequenzen des 3 T-Hochfeldsystems gegenüber der Standardwinkelung und des Niederfeldsystems ermittelt werden. Des Weiteren konnte in beiden Systemen eine Erhöhung des Kontrast-Rausch-Verhältnisses mit steigender Zellzahl beobachtet werden. Außerdem zeigte die T1-gewichtete Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-
Effektes sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem das höchste Kontrast-Rausch-Verhältnis. Bei der qualitativen lichtmikroskopischen Auswertung der Preußischblau-gefärbten Proben konnte in allen Zellzahlen der Nachweis Preußischblau-positiver Strukturen erbracht werden. Der Großteil dieser positiven Strukturen war innerhalb spindelförmiger Zellen lokalisiert. Darüber hinaus konnte ein signifikant höheres Volumen Preußischblau-positiver MSC bei einer Zellzahl von 106 im Vergleich zu einer Zellzahl von 104 ermittelt werden (p <0,05). Des Weiteren konnte Fluoreszenzmikroskopisch in allen markierten Proben die Präsenz Rhodamin B-positiver Zellen entlang der Schnittinzisionen nachgewiesen werden.
Schlussfolgerung: Spio-markierte MSC sind in Abhängigkeit von ihrer Zellzahl im Nieder- und Hochfeld-MRT nachweisbar. Es ist eine Detektion ab einer Zellzahl von 105 im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T möglich. Des Weiteren ist die Visualisierung markierter MSC in einer Zellzahl von 104 in einem Hochfeld-MRT 7 T realisierbar. Darüber hinaus ist es mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes möglich Spio-markierte MSC in gesundem Sehnengewebe im Nieder- und Hochfeldsystem zu detektieren. Als besonders geeignet konnte aufgrund des höheren
Kontrast-Rausch-Verhältnisses die T1-gewichtete Sequenz ermittelt werden.
Die Technik dieser Studie kann für zukünftige in-vivo-Studien zur Biodistribution von MSC und dem longitudinalen Zelltracking im Organismus von großem Nutzen sein.:1 EINLEITUNG ................................................................................................................. 1
2 LITERATURÜBERSICHT .............................................................................................. 3
2.1 Anatomie und Physiologie der Sehne am Beispiel der Oberflächlichen
Beugesehne des Pferdes ......................................................................................... 3
2.1.1 Makroskopische Anatomie der Oberflächlichen Beugesehne .................................. 3
2.1.2 Struktureller Aufbau und mikroskopische Anatomie ................................................ 6
2.2 Sehnenerkrankungen ............................................................................................... 7
2.2.1 Allgemeines und Definition ...................................................................................... 7
2.2.2 Pathophysiologie ..................................................................................................... 9
2.2.3 Sehnenheilung .......................................................................................................12
2.2.4 Diagnostik von Sehnenerkrankungen .....................................................................14
2.2.5 Therapie .................................................................................................................17
2.3 Multipotente Mesenchymale Stromazellen ............................................................21
2.3.1 Allgemeines ...........................................................................................................21
2.3.2 Einsatz von MSC bei Erkrankungen der equinen Oberflächlichen Beugesehne .....23
2.3.3 Wirkmechanismus ..................................................................................................24
2.3.4 Longitudinales Zelltracking .....................................................................................25
2.4 Magnetresonanztomografie ....................................................................................28
2.4.1 Allgemeines ...........................................................................................................28
2.4.2 Physikalische Prinzipien .........................................................................................28
2.4.3 Relaxation ..............................................................................................................30
2.4.4 Bildkontrast ............................................................................................................31
2.4.5 Repetitionszeit ........................................................................................................32
2.4.6 Echozeit .................................................................................................................32
2.4.7 Darstellung von Sehnen und Bändern ....................................................................33
2.4.8 Magic-Angle-Effekt .................................................................................................34
2.4.9 Suszeptibilitätsartefakte .........................................................................................35
3 ZIELSTELLUNG UND HYPOTHESEN .........................................................................38
4 MATERIAL UND METHODEN ......................................................................................39
4.1 Übersicht Versuchsaufbau......................................................................................39
4.2 Isolation der MSC ....................................................................................................39
4.3 Zellaufbereitung .......................................................................................................40
4.3.1 Expansion der MSC ...............................................................................................41
4.3.2 Markierung der MSC ..............................................................................................41
5.6 Histologie .................................................................................................................77
5.6.1 Preußischblau-Färbung ..........................................................................................77
5.6.2 Vergleich der Volumen der Preußischblau-positiven Strukturen zum Volumen der
hypointensen Artefakte im MR-Bild ........................................................................79
5.6.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................................84
5.6.4 Diamino-2-Phenylindol- (DAPI) -Färbung ...............................................................85
6 DISKUSSION ................................................................................................................87
6.1 Diskussion Material und Methodik .........................................................................87
6.1.1 Equine Oberflächliche Beugesehne .......................................................................87
6.1.2 Zellmarkierung und Zellviabilität .............................................................................87
6.1.3 Magnetresonanztomografie ....................................................................................88
6.1.4 Histologie ...............................................................................................................89
6.2 Diskussion Ergebnisse ...........................................................................................90
6.2.1 Magnetresonanztomografie ....................................................................................90
6.2.2 Histologie ...............................................................................................................95
6.3 Schlussfolgerung aus den Ergebnissen ................................................................95
7 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................96
8 SUMMARY....................................................................................................................98
9 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................ 100
ANHANG ........................................................................................................................... 115
DANKSAGUNG ................................................................................................................. 120
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:34293 |
| Date | 20 June 2019 |
| Creators | Offhaus, Julia |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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