Atrial fibrillation (AF) is the most common and relevant arrhythmia in the clinical routine. AF is predicted to affect 6–12 million patients in the USA by 2050 and 18 million patients in Europe by 2060. Cardiac fibrosis and inflammation decisively determine the course of the disease and the clinical outcome of the patients. Despite the tremendous impact on human health, detailed understanding on the molecular mechanisms that contribute to fibrosis in AF is limited. This study provides further evidence for the current paradigm shift that atrial fibrillation is more of a systemic-inflammatory disease than a mere ion-channel dysfunction. The aim of this study was to investigate the role of polo-like kinase 2 (PLK2) and the pro-inflammatory cytokine osteopontin (OPN) with respect to fibroblast (dys)function and fibrosis formation in order to derive novel targets for targeted, fibroblast-specific pharmacotherapy. All patients who participated in this study gave their written informed consent in accordance to the declaration of Helsinki. The study was approved by the local bioethics committee (Ethikkommission an der Technischen Universität Dresden). Human fibroblasts were isolated by outgrowth culture from right atrial biopsies of patients suffering from sinus rhythm (SR) and AF. Murine fibroblasts were isolated by whole-heart Langendorff-perfusion. Quantitative PCR and western blot were used to detect PLK2 transcript expression and protein abundance, respectively. Functional assessment of cardiac function was done with transthoracic echocardiography and surface ECG recordings. Cell culture experiments were performed to evaluate the effects on functional fibroblast properties such as proliferation and differentiation after changing PLK2 activity by genetic knockout (KO) or pharmacological inhibition. A mass spectrometry based secretome analysis was performed by our collaborating laboratory of Prof. Manuel Mayr at King’s College London. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was done to measure OPN in the peripheral blood of patients in SR and with permanent AF. Right atrial appendage tissue and fibroblasts from AF patients displayed significantly lower expression of PLK2 mRNA and protein due to increased DNA-methylation of the PLK2 promotor when compared to sinus rhythm (SR) control patient atria or fibroblasts. This methylation was induced in cardiac fibroblasts by chronic hypoxia (1% O2) exposure for 96 h. Pharmacological inhibition as well as global KO of PLK2 in cardiac fibroblasts resulted in elevated myofibroblast differentiation and reduced fibroblast proliferation. PLK2 KO mice displayed vast interstitial fibrosis areas as observed from histological cross sections stained either with Sirius red or with Masson’s trichrome staining. Transthoracic echocardiography revealed systolic and diastolic dysfunction in PLK2 KO mice and AF-typical ECG alterations such as prolonged PQ interval and QRS duration. Mass spectrometry proteomics revealed de novo expression of OPN in the PLK2-KO-fibroblast secretome. Furthermore, we found higher OPN plasma levels in AF patients correlated with electrophysiologically determined fibrosis compared to non-fibrosis control patients. Finally, we identified that the p42/44 MAPK signal transduction cascade is linking to reduced PLK2 expression and enhanced OPN release. Specifically, we found that KO of PLK2 increase p42 MAPK phosphorylation which is known to stimulate OPN transcription. Thus inhibition of p42/44 MAPK resulted in diminished OPN expression. In a dermal fibrosis model the administration of Mesalazine in vitro resulted in reduced p42 MAPK and SMAD2/3 phosphorylation and thereby reduced OPN and αSMA expression. To explore the general validity and relevance of the PLK2 signaling pathway for fibrosis, a dermal model of radiation-induced fibrosis was used. This approach a) confirmed the observations that were made in the heart and b) showed that the use of Mesalazine in vitro led to a reduced p42 MAPK and SMAD2 / 3 phosphorylation and thus to a significantly reduced OPN and αSMA expression. Fibroblasts from patients with permanent AF express less PLK2 than cells from SR control patients. The loss of physiological PLK2 activity coincides with marked changes in the proliferation and differentiation of cardiac fibroblasts. These changes favor fibrosis in the atrial tissues, which is further enhanced by the local and systemic increase of OPN. The present study identifies PLK2 as a novel regulator of cardiac fibroblast function and fibrosis. Restoration of the physiological methylation status of the PLK2 promoter or the inhibition of OPN with Mesalazine could be of particular clinical interest. The tangible clinical and pharmacological feasibility will be subject of future investigations. / Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste und bedeutsamste Arrhythmie in der täglichen klinischen Praxis. VHF wird bis 2050 voraussichtlich 6 -12 Millionen Menschen in den USA und bis 2060 zirka 18 Millionen Menschen in Europa betreffen. Fibrose und Entzündungsprozesse bestimmen entscheidend den Krankheitsverlauf und das klinische Outcome der Patienten. Trotz dieser großen Relevanz sind detaillierte Informationen zu den beteiligten molekularen Pathomechanismen weitgehend unklar. Diese Studie liefert weitere Evidenz für den aktuellen Paradigmenwechsel, dass Vorhofflimmern eher eine systemisch-entzündliche Erkrankung als eine bloße Ionenkanaldysfunktion ist. Ziel dieser Arbeit war es die Rolle der polo-like Kinase 2 (PLK2) und des proinflammatorischen Zytokins Osteopontin (OPN) im Hinblick auf Fibroblasten(dys)funktion und Fibroseentstehung zu untersuchen, um neuartige Angriffspunkte für zielgerichtete, Fibroblasten-spezifische Pharmakotherapie abzuleiten. Alle Patienten wurden über die Teilnahme an der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die vorliegende Studie ist konform mit der Deklaration von Helsinki und enthaltene Tierversuche erhielten ein positives Votum der lokalen Tierschutzbehörde. Humane Vorhoffibroblasten wurden mit der „Outgrowth“-Methode aus Gewebeproben von Patienten im Sinusrhythmus (SR) und im permanenten Vorhofflimmern isoliert. Murine Herzfibroblasten wurden aus dem Überstand nach Langendorff-Perfusion durch mehrere Zentrifugationsschritte gewonnen. Zur Detektion von PLK2 und anderen Markerproteinen wurden (quantitative) PCRs und Western Blots durchgeführt. Zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo, wurde transthorakale Echokardiografie mit Oberflächen-EKG-Ableitung genutzt. Nachfolgende Zellkulturexperimente beleuchteten die Auswirkungen pharmakologischer PLK2 Inhibition oder genetischen Knock-Outs auf Fibroblasten im Hinblick auf Proliferation, Differenzierung, Seneszenzentwicklung und Sekretion. Eine Massenspektrometrie-basierte Untersuchung des Sekretoms PLK2-defizienter Fibroblasten wurde im Labor unseres Kollaborationspartners Prof. Manuel Mayr am King’s College London durchgeführt. OPN im peripheren Blut von Vorhofflimmerpatienten wurde mittels eines ELISAs gemessen. Ob die betreffenden Patienten Fibrose der Vorhöfe aufwiesen oder nicht, wurde in klinisch-elektrophysiologischen Untersuchungen, dem sogenannten Mapping, bestimmt. Im Vergleich zu SR-Kontrollen, war die PLK2 mRNA- beziehungsweise Protein-Expression in isolierten Fibroblasten und auf Gewebeebene in VHF-Proben signifikant erniedrigt. Dies korrelierte mit PLK2-Promotermethylierung in der Hälfte der VHF-Proben. In SR-Kontrollen konnten wir keine Methylierung des PLK2 Promoters nachweisen. Die Herunterregulation der PLK2 mRNA-Expression bzw. die Induktion der Promotermethylierung konnten in humanen kardialen Fibroblasten durch Exposition gegenüber chronischer Hypoxie (1% O2) experimentell herbeigeführt werden. Pharmakologische Inhibition und der genetische Knockout (KO) von PLK2 gingen in vitro mit erniedrigter Proliferation aber gesteigerter Differenzierung in Myofibroblasten einher. PLK2-KO-Mäuse entwickelten im Gegensatz zu ihren Wildtyp-Geschwistertieren ausgeprägte Areale interstitieller ventrikulärer Fibrose. Dies spiegelte sich in einer ausgeprägten systolischen und Diastolischen Funktionsstörung des Herzens bei 4 Monate-alten PLK2 KO Tieren wider. Die Sekretomanalyse deckte eine de novo Sekretion von OPN in PLK2-KO-Fibroblasten auf. Im Einklang mit diesem Ergebnis konnten wir höhere OPN-Plasmaspiegel auch bei VHF-Patienten messen, die mit dem Vorhandensein von elektrophysiologisch bestimmten Fibrosearealen korrelierte. Abschließend konnte der p42/44-MAPK-Signalweg als Bindeglied zwischen erniedrigter PLK2-Expression und erhöhter OPN-Freisetzung identifiziert werden. Verminderte PLK2 Expression beziehungsweise Aktivität gehen mit einer gesteigerten Proteinexpression und Phosphorylierung von p42/44 MAPK einher. P42/44 MAPK wiederum stimuliert dann die OPN-Transkription. Folgerichtig führte die Inhibition von p42/44 MAPK zu einer signifikant verminderten OPN-Expression. Um die Allgemeingültigkeit des PLK2-Signalweges für die Entstehung von Fibrose zu erforschen, wurde ein dermales Modell strahleninduzierter Fibrose benutzt. Darin bestätigten sich zum einen die Beobachtungen, die am Herzen gemacht wurden, und zum anderen führte der Einsatz von Mesalazin in vitro zu einer reduzierten p42 MAPK- und SMAD2 / 3-Phosphorylierung und damit zu einer deutlich verringerten OPN- und αSMA-Expression.
Fibroblasten von Patienten im permanenten Vorhofflimmern exprimieren weniger PLK2 als Fibroblasten aus SR-Kontrollpatienten. Der Verlust der physiologischen PLK2-Aktivität geht mit ausgeprägten Veränderungen der Proliferation und Differenzierung von Fibroblasten im Herzen einher. Diese Veränderungen begünstigen eine profibrotische Situation auf Gewebeebene, welche durch die lokale als auch systemische Erhöhung des Plasmaosteopontins weiter begünstigt wird. Die vorliegende Studie identifiziert erstmalig PLK2 als neuen Regulator der Fibroblastenfunktion und Fibrose. Gleichzeitig stellen die Wiederherstellung des physiologischen Methylierungstatuses des PLK2 Promoters oder die Inhibition von OPN mittels Mesalazin vielversprechende therapeutische Optionen im Kampf gegen die Fibrosierung des Herzmuskels dar. Die konkrete pharmakotherapeutische Umsetzbarkeit muss in künftigen Forschungsvorhaben überprüft werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:35454 |
| Date | 20 September 2019 |
| Creators | Künzel, Stephan Reinhard |
| Contributors | El-Armouche, Ali, Wielockx, Benjamin, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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