Subklinische entzündliche Veränderungen des Endometriums können nur durch die histopathologische Untersuchung eines Bioptates diagnostiziert werden und sind von besonderer Bedeutung bei Fertilitätsstörungen. Die nicht-eitrige (NE) Endometritis ist gekennzeichnet durch eine Infiltration des Endometriums mit Lymphozyten, Plasmazellen und/oder Makrophagen. Die genaue Pathogenese ist unklar. Die immunhistologische Phänotypisierung dieser Zell-(sub-)populationen kann möglicherweise pathogenetische Hinweise geben. Der immunhistologische Nachweis equiner Immunzellen ist jedoch fast ausschließlich an Gefrierschnitten etabliert. Dies ist für die Routinediagnostik ungeeignet. Demzufolge ergaben sich die folgenden Ziele: 1. Eine alternative Methode zur Gewebsfixierung zu etablieren, die in der Routinediagnostik praktikabel einsetzbar ist, die einen guten Strukturerhalt, eine geeignete Anfärbbarkeit und ideale Auswertbarkeit gewährleistet sowie umfangreiche immunhistochemische Untersuchungen ermöglicht; 2. Die immunhistochemische Phänotypisierung von Lymphozyten- und Makrophagen-(sub-)populationen an fixierten equinen Gewebeproben zu entwickeln; 3. Eine semiquantitative Bestimmung der endometrialen Entzündungszellen ohne und mit einer NE Endometritis durchzuführen. Tiere, Material & Methoden: Gewebeproben (Lymphknoten als Referenzgewebe und endometriales Gewebe) wurden von 5 Stuten im Rahmen der Sektion entnommen, in Formalin (F), HOPE® (H) oder IHC Zinc Fixative (Z) fixiert und zusätzlich als natives Gefriermaterial aufgearbeitet. Es erfolgte eine vergleichende Beurteilung der Gewebemorphologie, des Färbeverhaltens und der Artefakte am equinen Endometrium in HE gefärbten Gefrierschnitten bzw. im fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). Equine Lymphknoten dienten als Referenzgewebe für die immunhistochemische Etablierung der Lymphozytenmarker (anti-CD3, -CD4, -CD8) an Gefrierschnitten und am fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). F- und Z-fixiertes Referenzgewebe (Leber, Dünndarm, Darmlymphknoten) von 4 Stuten wurde für die Etablierung der Makrophagenmarker (anti-CD172a, -CD14, -CD206) verwendet. Die Immunreaktionen der Primärantikörper wurden verglichen. Als Resultat aus den vergleichenden Analysen wurde die Z-Fixierung als effektivste alternative Fixierungsmethode ausgewählt. Im abschließenden Teil der Untersuchungen wurden 28 Z-fixierte Endometriumbioptate hinsichtlich der Entzündungszellen semiquantitativ ausgewertet. 4 Stuten zeigten keine Entzündungsreaktion und dienten als Kontrolle. 24 Stuten wiesen eine oberflächliche NE Endometritis auf. Die Anzahl CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD14+ und CD206+ Zellen sowie die Anzahl von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung wurde an Serienschnitten in 5 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern (400x) jeweils für das Stratum compactum, Stratum spongiosum und das luminale sowie glanduläre Epithel erhoben. Ergebnisse: 1. Die Z-Fixierung zeigt mit der F-Fixierung vergleichbare, exzellente Eigenschaften hinsichtlich des Strukturerhalts, der Anfärbbarkeit und Auswertbarkeit. Sie übersteigt insgesamt die Eigenschaften der H-Fixierung: die Z-Fixierung erweist sich einfacher in der Anwendung und zeigt eine geringere Artefaktbildung. 2. Die immunhistochemische Charakterisierung von T- und B-Lymphozyten, Helfer-T-Lymphozyten sowie zytotoxischen T-Lymphozyten und Makrophagenpopulationen sowie der Nachweis von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung an Z-fixierten equinen Gewebeproben ist möglich. 3. Im entzündlich veränderten Endometrium sind mehr CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ Zellen sowie Plasmazellen nachweisbar als in unveränderten Gewebeproben bezogen auf das Stratum compactum und Stratum spongiosum. Die durchschnittliche Anzahl CD3+ Zellen ist im Stratum compactum NE Endometritiden knapp 3x höher als im unveränderten Endometrium. Wenige CD20+ B-Zellen und CD172a+ Makrophagen sowie eine unterschiedliche Anzahl an Plasmazellen sind innerhalb des Stratum compactum entzündlich veränderter Endometrien nachweisbar. Es existieren große individuelle Unterschiede in der Anzahl CD4+ und CD8+ T-Zellen in Endometrien ohne sowie mit einer Entzündung. Schlussfolgerungen: Eine Integration der Z-Fixierung in die Routinediagnostik mit zusätzlichen Anwendungsmöglichkeiten ist problemlos möglich. Die immunhistochemische Entzündungszelldifferenzierung im Endometrium der Stute kann an fixierten equinen Endometriumbioptaten durchgeführt werden und bietet darüber hinaus die Möglichkeit, diese Methode an anderen equinen Organen anzuwenden. Die Ergebnisse der semiquantitiven Auswertung deuten auf das mögliche Vorliegen unterschiedlicher Formen der nicht-eitrigen Entzündung hin. Das etablierte Verfahren gibt möglicherweise nähere Hinweise auf immunologische Konstellationen, die das Auftreten einer nicht-eitrigen Endometritis begünstigen.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 2
2.1 Das Endometrium der Stute 2
2.1.1 Endometritiden 4
2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4
2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5
2.1.1.3 Sonderformen 6
2.1.2 Resistant und susceptible mares 8
2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10
2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13
2.2 Immunologie 14
2.2.1 T-Lymphozyten 14
2.2.2 B-Lymphozyten 17
2.2.3 Makrophagen 18
2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21
2.3 Fixierungsmethoden 24
2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26
3 PUBLIKATIONEN 28
3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28
3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39
4 DISKUSSION 53
4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54
4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell-
(sub-)populationen 59
4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60
5 ZUSAMMENFASSUNG 63
6 SUMMARY 65
7 LITERATURVERZEICHNIS 67
8 DANKSAGUNG 81 / Clinically unapparent inflammatory alterations of the equine endometrium can only be diagnosed by the histopathological examination of a biopsy and are the main cause of subfertility in mares. The non-suppurative endometritis is characterised by infiltration of the endometrium with lymphocytes, plasma cells and/or macrophages. So far, the cause and pathogenesis of non-suppurative endometritis are unclear. The subclassification of the immune cell populations involved will likely provide important information on the etiology and pathogenesis of this disease. Available antibodies are often established exclusively for immunohistochemistry on cryostat sections of native frozen equine tissue. However, this method is impractical for the routine diagnostic work-up. The aim of the present study was: 1. To reveal the method most suitable for a routine diagnostic work-up in combination with proper tissue preservation, staining results as well as histological and immunohistochemical analysis; 2. To establish an immunohistochemical method for the detection of lymphocytes and macrophages including their subpopulations in fixed equine tissue samples; 3. To characterize the immune cell populations in fixed endometria of mares without and with non-suppurative endometritis. Material & methods: Equine endometrial tissue and intestinal lymph node were obtained from five mares during post mortem examination and were either fixed in formalin, HOPE® or IHC Zinc Fixative. Aditionally snap frozen tissue samples were processed for cryostat sectioning. HE stained cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) of the equine endometrium were analysed regarding tissue preservation, staining results and artefacts. To establish lymphocyte markers (anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8) immunohistochemically on cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) equine lymph node was used as reference. Formalin fixed and zinc fixed tissue samples with macrophage populations (liver, small intestine, intestinal lymph node) from four mares were used for the immunohistochemical establishment of the macrophage markers (anti-CD172a, anti-CD14, anti-CD206). The immunoreactivity of the primary antibodies was compared. The results of the comparative analysis revealed the most suitable alternative fixation method (zinc fixation). Finally, 28 zinc fixed endometrial biopsies were evaluated semiquantitatively with regard to the numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ lymphocytes, CD172+, CD14+, CD206+ macrophages as well as plasma cells. Four mares had no evidence of endometritis and represent the control group. The remaining 24 mares showed a mild superficial non-suppurative endometritis. The comparative analysis was performed in serial sections within five randomly selected high power fields (400x). Positive cells were counted separately within the luminal and glandular epithelium, the stratum compactum and the stratum spongiosum. Results: 1. The zinc fixation provides excellent staining results, tissue preservation and allows histological and immunohistochemical analysis. It has even some advantages compared to the HOPE® fixation regarding the routine diagnostic work-up. The zinc fixation produces less artefacts. 2. The zinc fixation allows the immunohistochemical detection of all applied T- and B-lymphocyte-, helper- and cytotoxic-T-cell- and macrophage-markers and the histochemical detection of plasma cells (methyl green-pyronin stain) within equine fixed tissue. 3. Endometria with non-suppurative endometritis have higher numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ as well as plasma cells within the stratum compactum and stratum spongiosum than endometria without inflammation. The average cell count of CD3+ lymphocytes within the stratum compactum was approximately 3 x higher within inflamed endometria than this value obtained from endometria without endometritis. Few CD20+ B cells and CD172+ macrophages as well as variable numbers of plasma cells could be detected within the stratum compactum of mares with non-suppurative endometritis. Endometria with and without inflammation showed marked differences in the numbers of CD4+ and CD8+ T cells. Conclusion: The zinc fixation can be easily incoorporated into the routine diagnostic work-up and offers additional application possibilities. Immunohistochemical phenotyping of immune cells in the equine endometrium can be performed on fixed endometrial biopsies of the mare. Furthermore, a widespread applicability is possible, e. g. on other equine organs. These findings suggest the existence of different forms of non-suppurative endometritis. The established method will likely assist to reveal possible etiologies and predisposing conditions for non-suppurative endometritis.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 2
2.1 Das Endometrium der Stute 2
2.1.1 Endometritiden 4
2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4
2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5
2.1.1.3 Sonderformen 6
2.1.2 Resistant und susceptible mares 8
2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10
2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13
2.2 Immunologie 14
2.2.1 T-Lymphozyten 14
2.2.2 B-Lymphozyten 17
2.2.3 Makrophagen 18
2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21
2.3 Fixierungsmethoden 24
2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26
3 PUBLIKATIONEN 28
3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28
3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39
4 DISKUSSION 53
4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54
4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell-
(sub-)populationen 59
4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60
5 ZUSAMMENFASSUNG 63
6 SUMMARY 65
7 LITERATURVERZEICHNIS 67
8 DANKSAGUNG 81
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:36092 |
| Date | 13 November 2019 |
| Creators | Rudolph (geb. Huth), Nicole |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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