Einleitung: Ein häufiger Befund in routinemäßig untersuchten Bioptaten equiner Endometrien sind degenerative Alterationen der Blutgefäße in Form von Angiosklerosen. Sie stellen die Ursache einer endometrialen Minderperfusion dar und bedingen Fruchtbarkeitsstörungen.
Ziele der Untersuchungen:
Der Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung equiner Endometriumproben mit graduell vari-ablen Angiosklerosen. Die Hypothese ist, dass degenerative Gefäßwandveränderungen die Ursache für einen hypoxischen Zustand darstellen. Anhand der Expression von so genannten Hypoxiemarkern sollte das Vorliegen eines potenziellen Sauerstoffmangels in Folge einer Minderperfusion durch degenerative Blutgefäßwandveränderungen überprüft und immunhis-tologisch dargestellt werden. Des Weiteren sollten Zusammenhänge zu anderen Einflussfak-toren wie zum Beispiel dem Zyklusstand, dem Vorliegen einer Trächtigkeit, dem Alter oder einer Endometrose untersucht werden.
Tiere, Material und Methoden:
Grundlage für diese Untersuchungen waren vor allem equine Endometriumbioptate aus der Routinediagnostik des Instituts für Veterinär-Pathologie. Anhand mittels Pikrosiriusrot gefärb-ter Bioptate wurden Gruppen ohne Alterationen von maximal 5-jährigen Maidenstuten (n = 10) sowie mit ausschließlich graduell variablen Angiosklerosen (jeweils n = 10 mit dezenter, geringgradiger, gering- bis mittelgradiger, mittelgradiger und mittel- bis hochgradiger sowie n = 8 mit hochgradiger Angiosklerose) gebildet. Des Weiteren wurden aus dem Sektionsgut des Instituts Endometriumproben von tragenden Stuten (n = 6), eine weitere Uterusprobe einer trächtig geschlachteten Stute, Bioptate mit gering- bzw. hochgradiger Endometrose in Kombi-nation mit gering- bzw. hochgradiger Angiosklerose (jeweils n = 6) und Bioptate, die an defi-nierten Zyklustagen (Östrus, früher bzw. später Diöstrus) entnommen wurden (jeweils n = 2) entsprechend graduiert.
Alle Proben wurden nach erfolgreicher methodischer Etablierung der Antikörper gegen hypo-xia-inducible factor 1α (HIF-1α), Glucosetransporter 1 (GLUT1), vascular endothelial growth factor A (VEGF A) und vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF-R2) hinsichtlich der Expression dieser Hypoxiemarker immunhistologisch untersucht. Für unterschiedliche Zellpopulationen (luminales Epithel und Zellen der Drüsenausführungsgänge, oberflächliche, mittlere und basale glanduläre Epithelzellen, Stromazellen) und die arteriellen und venösen Blutgefäße (jeweils getrennt nach Intima, Media und Adventitia) wurde markerweise der Im-munreaktive Score (IRS) aus jeweils 10 nebeneinander liegenden Gesichtsfeldern bei 400-facher Vergrößerung (Zellpopulationen) bzw. jeweils 5 Arterien, Arteriolen, Venen und Venulen bestimmt. Die statistische Untersuchung erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS 22 (SPSS Software-GmbH, München). Die Datenvisualisierung wurde mit GraphPad Prism 8 (Graphpad Software Inc., San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt.
Ergebnisse:
Eine Expression der Hypoxiemarker lässt sich in unterschiedlichen Zellpopulationen darstel-len. HIF-1α ist in nahezu allen Proben im luminalen Epithel, in den Drüsenepithelzellen und in Intima und Media von vor allem arteriellen Gefäßen nachweisbar. Ein nicht signifikanter Trend zu einem höheren IRS zeigt sich erst ab mittel- bis hochgradigen Angiosklerosen in den Drüsenepithelzellen. Demgegenüber lässt sich eine verminderte Expression in der Media von arteriellen Gefäßen erkennen, die für vier Angiosklerose-Gruppen auch statistisch signifikant ist. GLUT1 kann vor allem im Bereich des luminalen Epithels und der Zellen der Drüsenaus-führungsgänge sowie vereinzelt auch in Drüsenepithelzellen nachgewiesen werden. Die ins-gesamt graduell variable Expression sinkt tendenziell mit steigendem Angiosklerosegrad, al-lerdings nicht statistisch signifikant. VEGF A wird von nahezu allen untersuchten Zellpopulati-onen sowie Blutgefäßen und in nahezu allen Proben relativ konstant hoch exprimiert. Zu einer vermehrten Expression kommt es ab Vorliegen einer mittelgradigen Angiosklerose vor allem in den glandulären Epithelzellen, welche bei hochgradiger Angiosklerose auch als statistisch signifikant anzusehen ist. Eine VEGF-R2-Expression lässt sich ebenfalls vorrangig im glan-dulären und luminalen Epithel erkennen, wenngleich sie sich überwiegend geringgradig dar-stellt. Deutliche Unterschiede lassen sich hier in keiner untersuchten Zellpopulation erkennen.
Im Zusammenhang mit einer Trächtigkeit zeigen sich Unterschiede in der Expression bei dreien der vier Marker im Bereich des luminalen Epithels und der Zellen der Drüsenausfüh-rungsgänge, also der Schicht, die an der Bildung der feto-maternalen Verbindung beteiligt ist. Im Vergleich zwischen normalen und endometrotischen Drüsen zeigen sich für alle Marker Unterschiede im Expressionsverhalten, die allerdings nicht statistisch signifikant sowie scheinbar unabhängig vom Angiosklerosegrad sind. Eine deutliche Zyklusabhängigkeit konnte nicht nachgewiesen werden.
Schlussfolgerungen:
Mittels der durchgeführten Untersuchungen wird deutlich, dass insbesondere schwere Angi-osklerosen für immunhistologisch darstellbare hypoxische Zustände sorgen. Ferner zeigen die eigenen Untersuchungen, dass sich die endometrialen Zellpopulationen hinsichtlich der Ex-pression der untersuchten Marker unterscheiden. Dabei wird außerdem deutlich, dass es nicht zwangsläufig zu dem erwarteten Anstieg der Expression der Hypoxiemarker kommen muss. Aus diesem Grund sollte zur Beurteilung des Vorliegens einer Hypoxie eine Untersu-chung der Expression mehrerer derartiger Marker erfolgen. Ein gänzlicher Ausschluss von anderen Einflussfaktoren als Hypoxie auf die Expression der untersuchten Marker kann im verwendeten Studienaufbau nicht erfolgen. Zukünftige Untersuchungen sollten zum einen einen größeren Probenumfang (insbesondere bei der Untersuchung anderer Faktoren als Angiosklerose) aufweisen sowie zum anderen weitere Hypoxiemarker umfassen. Die unter-suchten Marker spielen wahrscheinlich eine Rolle bei besonderen physiologischen (z. B. Trächtigkeit) als auch pathologischen Prozessen (z. B. Endometrose) im equinen Endometri-um und stellen somit interessante pharmakologische Targets zur positiven Beeinflussung der Reproduktionsleistung oder für die Therapie der equinen Endometrose dar. / Introduction: Degenerative alterations of the blood vessels, especially angiosclerosis, are a common finding in equine endometrial biopsies. They are the cause of an insufficient endo-metrial blood supply and therefore result in fertility problems.
Objectives:
The subject of this thesis was the examination of equine endometrial specimens with variable degrees of angiosclerosis. The hypothesis is that degenerative changes of the vessel wall are the cause of a hypoxic environment. The presence of a potential lack of oxygen as a result of hypoperfusion because of degenerative changes in the blood vessels was assessed via im-munohistochemistry by examining the expression of so-called markers of hypoxia. In addi-tion, the possible relationship to other factors such as the stage of the estrous cycle, pregnan-cy, age or endometrosis was considered.
Animals, material and methods:
This study is based on equine endometrial biopsies submitted to the diagnostic service of the Institute of Veterinary Pathology. By the means of picrosirius red stain, biopsy groups without any alterations of maiden mares with a maximum age of 5 years (n = 10) as well as biopsies with solely gradually variable angiosclerosis (n = 10 with minimal, mild, mild to moderate, moderate and moderate to severe, as well as n = 8 with severe angiosclerosis, respecively) have been established. In addition, specimens of pregnant mares from necropsied (n = 6) and
slaughtered (n = 1) horses, biopsies with mild and severe endometrosis in combination with mild and severe angiosclerosis (n = 6, respectively) and biopsies taken on certain days of the estrous cycle (estrous as well as early and late diestrous, n = 2, respectively) have been graduated likewise.
After their successful methodical establishment, all specimens have been examined im-munohistochemically via antibodies against hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), glucose transporter 1 (GLUT1), vascular endothelial growth factor A (VEGF A) and vascular endothe-lial growth factor receptor 2 (VEGF-R2) in regard to the expression of those markers for hy-poxia. The immunoreactive score (IRS) for each marker has been determined by examining 10 adjacent high-power fields (400-fold magnification) for the different endometrial cell popu-lations (luminal epithelium and cells of glandular ducts, superficial, mid and basal glandular epithelial cells, stromal cells), and 5 arteries, arterioles, veins, and venules, respectively, sepa-rated by intima, media and adventitia. The statistical analysis has been performed via data analysis software SPSS 22 (SPSS Software-GmbH, Munich). The visualisation of data has been done with GraphPad Prism 8 (Graphpad Software Inc., San Diego, California, USA).
Results:
Expression of the markers of hypoxia was demonstrated in different cell populations. HIF-1α could be detected in almost every specimen in the luminal and glandular epithelia as well as in the intima and media of blood vessels. A non significant trend towards increased IRS was observed in biopsies with at least moderate to severe angiosclerosis in the endometrial glands. In contrast, a diminished expression was identified in the media of arterial vessels, which was significant in four of the angiosclerosis groups. GLUT1 was detected in the luminal epithelium and the cells of glandular ducts as well as in some glandular epithelial cells. In total the ex-pression was variable, with a trend towards lower levels in cases with higher degrees of angi-osclerosis. VEGF A was constantly expressed on relatively high levels by all of the examined cell populations and blood vessels in almost all examined biopsies. There was a trend towards increased expression in cases with moderate angiosclerosis predominantly in the glandular epithelia, reaching statistical significance in endometrial biopsies which are severely altered by angiosclerosis. An expression of VEGF-R2 could be seen in glandular and luminal epitheli-al cells. Nevertheless, no distinct differences were evident.
In endometrial specimens of pregnant mares, expressional differences could be identified for three out of the four examined markers, especially in the luminal epithelium and the cells of glandular ducts, which are involved in the development of the feto-maternal connection. The comparison of normal with endometrotic glands revealed a complex expression pattern of all four examined markers which seemed to be independent of the degree of angiosclerosis. A distinct difference in dependence of the phase of the estrous cycle could not be detected.
Conclusions:
The current study demonstrated that severe angiosclerosis is the cause of an immunohisto-chemically detectable hypoxic condition. Furthermore, this study showed systematic differ-ences in the expression of the examined markers for the different endometrial cell popula-tions. Notably, the employed markers of hypoxia did not always show the expected increase in parallel with increasing grades of angiosclerosis. For that reason, the expression of multiple markers of hypoxia should be assessed to demonstrate a lack of oxygen in tissue samples using immunohistochemistry. The used study design did not allow the complete exclusion of other factors influencing the expression of the examined markers. Therefore, future studies should contain a larger pool of specimens on the one hand (especially while examining other factors than angiosclerosis) and employ a panel of markers of hypoxia. The examined mark-ers seem to play an important role during physiological (e. g. pregnancy) as well as pathologi-cal processes (e. g. endometrosis) and by that might be rewarding pharmacological targets to positively influence reproduction or to possibly treat equine endometrosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:72397 |
| Date | 09 October 2020 |
| Creators | Suchowski, Marcel |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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