Einleitung: Glioblastoma multiforme (GBM) gehören zu den häufigsten und bösartigsten Hirntumoren. Eine vollständige Heilung ist derzeit noch nicht möglich. Ziele: Es wurde ein orthotopes GBM-Xenotransplantat-Modell in der Maus etabliert, optimale Durchführungsprotokolle wurden erstellt und die Wachstumskinetik der Tumoren charakterisiert. Außerdem erfolgte eine lokale therapeutische Intervention mit Komplexen aus Polymeren und siRNAs (small interfering RNAs) bzw. AntimiRs (Anti-micro-RNAs) und der Verlauf wurde mittels Biolumineszenz-imaging (BLI) überwacht. Die tumortragenden Hirne wurden immunhistochemisch untersucht. Neben der Therapie wurden erstmals Tissue Slice Cokulturen aus Maushirnen mit orthotopen Xenotransplantaten hergestellt und durch immunhistochemische Untersuchungen bezüglich des Tumorwachstums und der Invasivität in das umliegende Normalgewebe charakterisiert. Des Weiteren wurde ein subkutanes (s.c.) Xenotransplantat-Modell etabliert, dessen Tumorwachstum mittels BLI überwacht wurde, welches eine therapeutische Applikation von PEI-komplexierten siRNAs enthielt und deren Tumoren mittels Messung der Proteinkonzentration und der Lumineszenz charakterisiert wurden. Mit dieser Arbeit wurden durch die Verwendung von siRNAs bzw. AntimiRs im Rahmen der RNA-Interferenz Strategien entwickelt, mit denen eine Grundlage für die spezifisch auf ein bestimmtes Gen gerichtete GBM-Therapie geschaffen werden konnte. Tiere, Material, Methoden: In insgesamt 190 immundefizienten Mäusen wurden s.c. und orthotope Xenotransplantate aus der Reporterzelllinie G55T2-Luc-GFP hergestellt. Eine Behandlungsgruppe mit s.c. Xenotransplantaten bestand aus 7-8 Tieren. Die Behandlungsgruppe erhielt intraperitoneale (i.p.) Injektionen des PEI-siRNA-Komplexes LP10Y-siLuc3 (LP10Y: AG Aigner, Universität Leipzig, Deutschland, siLuc3: Eurogentec, Belgien), während die Negativkontrollgruppe (NC) i.p. Injektionen mit dem Komplex LP10Y-siLuc2 erhielt. Diese Behandlung erfolgte 3 x wöchentlich über 6-12 d. Das Wachstum der Tumore wurde mit BLI in vivo verfolgt und die Lumineszenz im zeitlichen Verlauf gemessen. Die Tumore wurden lysiert und deren Lumineszenz bezogen auf die Proteinkonzentration gemessen. Für das orthotope Xenotransplantat wurde eine Schraube mit Führungskanal (Screw guide, Plastics One, USA) 1 mm rostral und 2 mm lateral des Bregmas stereotaktisch implantiert. Mit einer Mikroinfusionspumpe und einer Mikrodosierspritze wurden die Zellen über den Führungskanal mit 12 µl/ h in das rechte Striatum injiziert. 5-7 d nach der Inokulation der Zellen erfolgte das Einbringen von 3 µl der PEI-AntimiR bzw. siRNA-Komplexe PEI/antimiR-155-Komplex (PEI: AG Aigner, Universität Leipzig, Deutschland, AntimiR 155-ZEN: Integrated DNA Technologies, USA) bzw. LP10Y-siPLK1 (PLK1: Eurogentec, Belgien). Die Tiere der NC wurden mit den Komplexen PEI/antimiR-NC5-Komplex bzw. LP10Y-siLuc3 behandelt. Zum Vergleich wurde eine Gruppe gar nicht behandelt. Die Behandlung erfolgte 3 x wöchentlich über 12 d. Eine Behandlungsgruppe bestand aus 10 randomisiert verteilten Tieren. Das Wachstum wurde in vivo mit BLI verfolgt. Die Hirne wurden entnommen und mit einem Vibratom Gewebeschnitte erstellt, die mit Kresylviolett gefärbt und an denen mit einer Bildbearbeitungssoftware die Tumorflächen ausgemessen wurden. Außerdem wurden mit einem Mikrotom Paraffinschnitte hergestellt und diese immunhistochemisch beurteilt. Es wurden Tissue Slice Cokulturen aus unbehandelten Tumoren und gesundem Gewebe des Striatums bzw. Cortex erstellt und aus diesen ebenfalls Paraffinschnitte hergestellt, welche immunhistochemisch beurteilt wurden. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass ein Tumorwachstum s.c. injizierter GBM-Zellen in vivo mit BLI verfolgt werden kann und dass die siRNA siLuc3 mit LP10Y erfolgreich in G55T2-Luc-GFP eingeschleust wurde. Bei der Untersuchung der Luciferaseaktivität bezogen auf die Proteinkonzentration der lysierten s.c. Tumoren konnte eine Reduktion der Lumineszenz in der Behandlungsgruppe nachgewiesen werden. Das orthotope Xenotransplantat-Modell wies eine Tumoranwuchsrate von bis zu 96 % und eine Mortalitätsrate von bis zu 0 % auf. Das Tumorwachstum konnte nicht in vivo mit BLI verfolgt werden, da die umliegenden Gewebe die Lumineszenz vollständig abschirmten. Bei den Behandlungen mit LP10Y-siPLK1 und dem PEI/antimiR-155-Komplex konnte histologisch eine Reduktion der Tumorgröße und immunhistochemisch Apoptose und eine Tendenz zur Reduktion der Proliferation und Migration nachgewiesen werden. In der Behandlungsgruppe mit LP10Y-siPLK1 konnte außerdem eine verminderte Expression von PLK1 im Tumorgewebe und eine gesteigerte Überlebensrate nachgewiesen werden. Mit den Tissue Slice Cokulturen konnte festgestellt werden, dass die Xenotransplantate in den verschiedenen Hirnabschnitten unterschiedliches Migrationsverhalten zeigen. Die auf dem Cortex wachsenden Tumore waren kleiner als die auf dem Striatum wachsenden Tumore, wiesen jedoch mehr Migration in das umliegende Hirngewebe und mehr raumforderndes Wachstum im Verhältnis zum nicht raumfordernden Wachstum auf. Das Verhältnis der migrierenden Zellen zur Länge des Tumors des Xenotransplantats im Cortex wies höhere Werte auf als das im Striatum. Schlussfolgerungen: LP10Y eignet sich zur Einschleusung von siRNA und könnte ein vielversprechendes Nano-Therapeutikum darstellen. Das BLI von Luciferase exprimierenden, s.c. Tumoren ist ein gutes Verfahren zur Verfolgung der Wachstumskinetik. Es scheint sich jedoch nicht zur Untersuchung der Transfektionseffizienz von PEI-Komplexen zu eignen, da die Erscheinungsform von Glioblastomen mit Einblutungen, Nekrosen und Zysten sehr verschieden sein kann. Es ist also möglich dass die Tumoren unterschiedlich viele lebende Zellen pro Volumen mit entsprechender Luciferaseaktivität aufweisen. Alternativ dazu ist das Untersuchungsmodell der Lumineszenz bezogen auf die Proteinkonzentration lysierter Tumoren ein geeignetes Verfahren für die Quantifizierung der Luciferaseaktivität und der Transfektionseffizienz von PEI-Komplexen in GBM. Das im Zuge dieser Arbeit etablierte orthotope Xenotransplantat-Modell ist ein valides Modell mit verschiedenen Eigenschaften humaner GBM. Die Ergebnisse aus den Behandlungen der orthotopen GBM mit den PEI-siRNA bzw. AntimiRKomplexen sprechen für eine gute biologische Aktivität, niedrige Zytotoxizität, eine gute Knockdowneffizienz und somit auch therapeutische Effizienz der Komplexe in vivo. Das orthotope Xenotransplantat-Modell und die Tissue Slice Cokulturen stellen geeignete, gut reproduzierbare und genetisch unmanipulierte Modelle dar, welche die Untersuchung von Wachstums- und Migrationsverhalten mit und ohne therapeutische Intervention, sowie des Behandlungserfolges erlauben. Beide Polymere könnten vielversprechende Nano-Therapeutika darstellen. Ein neues exvivo-Modell, in dem die GBM in ihrer natürlichen Umgebung gewachsen sind und sich in der Cokultur weiterhin sehr ähnlich der Originalsituation verhalten können, wurde etabliert. Für die Statistiken wurde, zum Vergleich von Gruppen, der One-Way ANOVA-Test von SigmaPlot 13 verwendet.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:72800 |
| Date | 13 November 2020 |
| Creators | Schulz, Marion |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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