Einleitung: Osteoarthrose (OA) ist eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen beim Hund und wird definiert durch einen fortschreitenden Verlust der Knorpelschicht auf den Gelenksflächen. Therapeutika erster Wahl, wie nichtsteroidale Antiphlogistika, wirken rein palliativ und haben insbesondere bei der Langzeitgabe schädliche Nebenwirkungen. Bei der Suche nach Alternativen rückten Ergänzungsfuttermittel in den Focus der Forschung. Dabei zeigten mehreren Studien, dass eine Fütterung von Fischöl die klinischen Symptome von OA bei Hunden verbessert. Der dahinterliegende Wirkmechanismus ist jedoch beim Hund nicht erforscht.
Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war demnach, den genauen Wirkmechanismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) auf ausgewählte Schlüsselfaktoren der Knorpeldegeneration in einem Modellsystem der caninen OA zu untersuchen.
Material und Methoden: Wir etablierten ein Protokoll zur Isolierung von caninen Chondrozyten, kultivierten die Zellen erfolgreich bis zur Konfluenz und kryokonservierten sie für die weiteren Versuche. Um die Ansprechbarkeit der Zellen auf verschiedene Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen über 24 h mit 10 ng/ml Interleukin‑1β (IL‑1β) und mit 1 bis 10 ng/ml Transforming Growth Faktor‑β (TGF‑β) stimuliert und die Genexpression von Matrixproteinasen, induzierbarer Stickstoffmonoxid Synthase (iNOS) und Cyclooxygenase‑2 (COX‑2) sowie die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) und Prostaglandin E (PGE) gemessen (4 Spender, N=3). Auf Basis des etablierten Models wurden in einer zweiten Versuchsreihe die Zellen über 6 Tage mit n-3 Eicosapentaensäure (EPA), n-3 Docosahexaensäure (DHA) oder n-6 Arachidonsäure (AA) kultiviert und anschließend über 48 h mit IL‑1β stimuliert. Die Veränderung der IL‑induzierte Genexpression von Matrixproteinasen, iNOS und COX‑2 sowie die Produktion von PGE und NO unter Einfluss der Fettsäuren wurde analysiert (6 Spender, N=4). Darüber hinaus wurde die Fettsäureaufnahme und der Fettsäuremetabolismus via Gaschromatographie überprüft.
Um die Wirkungen der Fettsäuren und Stimulantien zu verifizieren, wurden die Daten einer zweifachen Varianzanalyse (AV) unterzogen. Bei signifikanten Einflüssen der Faktoren folgte ein Post-hoc-Test (Dunnett’s Test für die PUFA bzw. ein Bonferroni Test für die Stimulanzien). Die Signifikanzniveaus für AV- und die Post-hoc Tests wurden auf α = 0,01 eingestellt.
Ergebnisse: Unter der Stimulation mit IL‑1β kam es zu einem signifikanten Anstieg von degenerativen und entzündlichen Markern. Das Muster der Marker entsprach dabei dem Muster, welches unter natürlichen Bedingungen in erkrankten Gelenken vorzufinden ist. Somit haben wir ein simples und dennoch repräsentatives Modell für die canine OA etabliert. Im Gegensatz zu IL‑1β reduzierte TGF‑β konzentrationsabhängig signifikant den von IL‑1β induzierten Anstieg der inflammatorischen Marker und stellt sich somit als Gegenspieler zu diesem proinflammatorischen Zytokin dar. Die gegensätzliche Antwort der Zellen auf beide Zytokine bewies, dass die Chondrozyten in unserem Modell Charakteristika von differenzierten Zellen aufweisen.
Alle Fettsäuren wurden konzentrationsabhängig in die Zellen aufgenommen und metabolisiert. EPA reduzierte die IL‑induzierte Expression von iNOS und die damit im Zusammenhang stehende Produktion von NO signifikant. AA reduzierte ebenfalls iNOS und NO und außerdem die Expression von Matrixmetalloproteinase‑3 signifikant. Auf der anderen Seite steigerte AA signifikant die Produktion von PGE und die Expression von Aggrecanase ADAMTS‑5. DHA hatte auf keinen der untersuchten Marker einen Effekt.
Schlussfolgerungen: Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Studie die in Fütterungsversuchen dokumentierte positive Wirkung von n-3 PUFAs bei der caninen OA und bieten zudem eine Erklärung für die dahinterliegenden Mechanismen. Hervorzuheben ist, dass in dieser Studie nicht nur EPA, sondern auch AA eine positive Wirkung auf einzelne Marker erzielen. EPA scheint von allen untersuchten Fettsäuren die höchste Effektivität zu haben. Eine geringe Dosis an Fettsäuren über einen längeren Zeitraum führte nicht zu einer Akkumulation der Fettsäuren und hatte daher auf einige untersuchte Marker nur eine geringe Wirkung. Insgesamt lässt sich schlussfolgern, dass eine ausreichende Menge und ausgewogenes Verhältnis von n‑3 und n‑6 PUFA als unterstützende Therapie bei chronischen Gelenkserkrankungen beim Hund von großer Wichtigkeit ist. Besonders ein hoher Gehalt an EPA scheint dabei eine hohe Bedeutung für die Effektivität zu haben.:INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Physiologie und Anatomie des hyalinen Knorpels 3
2.1.1 Feinstruktur des Gewebes 3
2.1.2 Bedeutung der Chondrozyten 4
2.1.3 Aufbau der Extrazellulären Matrix (ECM) 5
2.2 Osteoarthrose (OA) 6
2.2.1 Pathogenese 6
2.2.1.1 Kausale Pathogenese 6
2.2.1.2 Formale Pathogenese 7
2.2.2 Die Rolle der Zytokine 9
2.2.2.1 Interleukin-1β (IL-1β) 9
2.2.2.2 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) 10
2.2.3 Rolle der Matrixproteinasen MMP und ADAMTS 12
2.2.4 Rolle der Entzündungsmediatoren 14
2.2.4.1 Stickstoffmonoxid (NO) 14
2.2.4.2 Prostaglandin E2 (PGE2) 15
2.3 Zellkulturmodelle für OA 16
2.4 Die canine OA 17
2.4.1 Ätiologie und Diagnose 17
2.4.2 Therapieansätze in der caninen OA 18
2.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) als Ergänzungsfuttermittel 20
2.5.1 Grundlagen des Fettsäurestoffwechsels 20
2.5.2 Fettsäurestoffwechsel im Knorpelgewebe 21
2.5.3 n-3 PUFAs als Therapieoption bei caniner OA 22
3 Ziel der Arbeit 25
4 Ergebnisse 26
4.1 Publikation 1 26
4.2 Publikation 2 36
5 Diskussion 47
5.1 Isolation und Anzucht von caninen Chondrozyten 47
5.2 IL-stimulierte canine Chondrozyten als Osteoarthrosemodell 51
5.3 TGF‑β als Gegenspieler von IL-1β 52
5.4 Fettsäuremetabolismus der Chondrozyten 54
5.5 Fettsäuren als Therapieoption bei der caninen OA 59
6 Schlussfolgerung 65
7 Zusammenfassung 66
8 Summary 68
9 Literaturverzeichnis 70
10 Danksagung 90 / Introduction: Osteoarthrosis (OA) is one of the most common musculoskeletal diseases in dogs and is defined by the progressive loss of the protective joint cartilage layer. First-choice treatments, like nonsteroidal anti-inflammatory drugs, act palliative only and are known to have harmful side effects especially in long-term usage. The urge to find alternative treatments moved nutraceuticals into the focus of research. In multiple trials, feeding fish oil improved the clinical symptoms of osteoarthritis in dogs. However, the underlying molecular mechanisms have not been investigated in dogs.
Aim of the Study: The aim of this study was therefore to further clarify how polyunsaturated fatty acids affect key factors of cartilage degeneration in a cell culture model for canine OA.
Materials and methods: We established a protocol for the isolation of canine chondrocytes, cultivated them successfully until confluency and cryoconservated them for further experiments. To examine the response of the cells to different cytokines, cells were stimulated for 24 h with 10 ng/ml Interleukin‑1β (IL‑1β) or 1 to 10 ng/ml Transforming Growth Factor‑β (TGF‑β). The gene expression of matrix proteinases, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase‑2 (COX‑2), the production of nitric oxide (NO) and prostaglandin E (PGE) were measured (4 donors, N=3). Using the established model, cells in the second trial were incubated with eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA) and arachidonic acid (AA) for 6 days and subsequently stimulated with IL‑1β for another 48 h. The change in IL‑induced gene expression of matrix proteinases, iNOS and COX‑2 as well as the production of NO and PGE under the influence of n‑3 EPA, n‑3 DHA and n‑6 AA was analysed (6 donors, N=4).
To verify the effects of the fatty acids and the stimulants, data were analysed with a two‑factorial analysis of variance (ANOVA). When there was a significant effect of the factors, a post-hoc test was performed (Dunnett’s test for PUFA, Bonferroni test for stimulants). Significance level for ANOVA- and the post hoc test was set at α = 0.01.
Results: Stimulation with IL-1β led to a significant increase of degenerative and inflammatory markers. This pattern of responsiveness was comparable to the events in naturally occurring OA. We therefore have established a simple yet representative model for canine OA. In contrast to IL‑1β, TGF‑β significantly decreased the IL‑induced inflammatory markers in a dose-dependent manner and therefore could counteract IL‑1β. The response of the cells to the cytokines indicates, that in our model, the chondrocytes have characteristics of differentiated cells.
All fatty acids were incorporated in a dose-dependent manner and metabolized. EPA decreased the IL-induced gene expression of iNOS and reduced the concomitant production of NO significantly. AA also decreased iNOS and NO significantly and downregulated the gene expression of matrix metalloproteinase‑3 significantly. On the other hand, AA significantly increased the production of PGE and the gene expression of the aggrecanase ADAMTS‑5. DHA had no effect on any of the markers.
Conclusions: Taking together, the results of this study add further weight to the beneficial effect of n‑3 PUFAs in canine OA and furthermore provide an explanation for the underlying mechanism. It is of importance, that not only the n‑3 fatty acid EPA but also the n‑6 fatty acid AA could provide beneficial effects on several markers. EPA seems to be the most effective of all fatty acids included in this study. A low concentration of fatty acids over a long period of time did not lead to an accumulation of fatty acids and therefore had a rather small impact on some of the investigated markers. Therefore, an optimal ratio between n‑3 and n‑6 and the adequate amount of fatty acids seems to be of high importance when treating chronic degenerative joint disease in dogs. However, a high content of EPA seems to be particularly effective.:INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Physiologie und Anatomie des hyalinen Knorpels 3
2.1.1 Feinstruktur des Gewebes 3
2.1.2 Bedeutung der Chondrozyten 4
2.1.3 Aufbau der Extrazellulären Matrix (ECM) 5
2.2 Osteoarthrose (OA) 6
2.2.1 Pathogenese 6
2.2.1.1 Kausale Pathogenese 6
2.2.1.2 Formale Pathogenese 7
2.2.2 Die Rolle der Zytokine 9
2.2.2.1 Interleukin-1β (IL-1β) 9
2.2.2.2 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) 10
2.2.3 Rolle der Matrixproteinasen MMP und ADAMTS 12
2.2.4 Rolle der Entzündungsmediatoren 14
2.2.4.1 Stickstoffmonoxid (NO) 14
2.2.4.2 Prostaglandin E2 (PGE2) 15
2.3 Zellkulturmodelle für OA 16
2.4 Die canine OA 17
2.4.1 Ätiologie und Diagnose 17
2.4.2 Therapieansätze in der caninen OA 18
2.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) als Ergänzungsfuttermittel 20
2.5.1 Grundlagen des Fettsäurestoffwechsels 20
2.5.2 Fettsäurestoffwechsel im Knorpelgewebe 21
2.5.3 n-3 PUFAs als Therapieoption bei caniner OA 22
3 Ziel der Arbeit 25
4 Ergebnisse 26
4.1 Publikation 1 26
4.2 Publikation 2 36
5 Diskussion 47
5.1 Isolation und Anzucht von caninen Chondrozyten 47
5.2 IL-stimulierte canine Chondrozyten als Osteoarthrosemodell 51
5.3 TGF‑β als Gegenspieler von IL-1β 52
5.4 Fettsäuremetabolismus der Chondrozyten 54
5.5 Fettsäuren als Therapieoption bei der caninen OA 59
6 Schlussfolgerung 65
7 Zusammenfassung 66
8 Summary 68
9 Literaturverzeichnis 70
10 Danksagung 90
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:72894 |
| Date | 27 November 2020 |
| Creators | Adler, Nadja |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.2460/ajvr.78.11.1264, 10.1111/jpn.12804 |
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