Der Typ 2 Diabetes mellitus ist eine chronische Stoffwechselerkrankung; hauptsächlich wird dieser durch das Versagen der Insulin-produzierenden _-Zellen und der gestörten Funktion des Insulin Rezeptors in periphären Geweben definiert. Obwohl die Forschung schon tief in die Geschichte greift und der Inzidenz Anstieg besorgniserregende Tendenzen zeigt, bleiben die pathophysiologische Grundlagen dieser Krankheit unklar. Die Voraussetzung für die Entwicklung des T2D und das zentrale Thema dieser Dissertation – das _-Zellen Versagen – wurde in den letzten Jahrzehnten aktiv erforscht. Viele aktuelle, in gewisen Maße überlappende, Hypothesen wurden aufgestellt, in einem Versuch die biologischen Grundlagen zu erläutern, die zum Versagen der _-Zellen führen und gleichzeitig mögliche Lösungen für dieses Problem zu finden. Während die Hypothesen, die auf den nicht-immunen Zelltentod als Ursache für Zellen Versagen beruhen, durch neue Studien an Zugkraft verlieren, bleiben andere mit ERStress und Dedifferenzierung als Schwerpunkt immer noch relevant. Alle bisher genannten Mechanismen leiden dennoch an geringer Reproduzierbarkeit und herausfordernden Translationsmöglichkeiten. Zudem hat sich die momentan meist genutzte experimentelle Plattform zunehmend als suboptimal erwiesen, denn sie basiert auf Gewinnung von Langerhassche Inseln durch enzymatische Isolierungsverfahren aus Spenderorganen; insbesondere für die Studien die sich methodologisch auf hoch-empfindliche Hochdurchsatzmethoden gründen. Frühere Arbeiten des Solimena-Labors mit Microarray-basierten transkriptomischen Signaturen haben deutlich gezeigt, was seit dem Aufkommen erschwinglicher omics-Methoden in diesem Bereich spekuliert wurde. Es hat sich gezeigt, dass diese hochsensiblen experimentellen Ansätze beeinträchtigt werden, vor allem durch die Verfahren, die zur Isolierung der Inseln aus der gesamten Bauchspeicheldrüse von Spendern erforderlich sind. Die Einführung von Signaturen, die eher ein Produkt des experimentellen Verfahrens als der biologischen Variabilität sind, stellte ein erhebliches Hindernis für die Interpretation der Daten dar, die aufgrund der verworrenen Natur der Auswirkungen der Krankheit auf die Zellbiologie selbst bereits komplex sind. Der Wert der Plattform „Studies of Islets in Living Donors' wurde durch das translationale Potenzial erhöht, das durch die verfügbaren klinischen Daten und die präoperative Erstellung von Stoffwechselprofilen definiert wird, die ansonsten durch den rechtlichen Rahmen für Organspenden stark eingeschränkt sind. In dieser Dissertation wurden LCM-Inseln von lebenden chirurgischen Spendern mit Hilfe von drei Hochdurchsatzmodalitäten profiliert: RNA-Sequenzierung, ungezielte massenspektrometrie-basierte Proteomik und enzymatische Methylierungssequenzierung. Für sich betrachtet, brachte jeder dieser Ansätze neue Erkenntnisse, und im Falle der RNA-Sequenzierung und der Proteomik wurden ausgewählte frühere Ergebnisse bestätigt. Die High-Level-Analyse der Insel-Transkriptome identifizierte eindeutig eine Untergruppe der Proben, die besonders stark mit Betazellen angereichert war, was durch die Dekonvolutionsanalyse bestätigt wurde. Dies ermöglichte vor allem die Identifizierung von differenziell regulierten Genen in den Inselzellen von Patienten mit gerstörten Glukosetoleranz, was einen neuen Einblick in die Entwicklung der Krankheit und nicht nur in die bereits vorhandene Krankheit bietet. Bei der differenziellen Expressionsanalyse wurde eine allgemeine Hochregulierung von Genen festgestellt, während die Gene-Set-Enrichment-Analyse dieser Daten auf Störungen bei Prozessen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel, der Translation und extrazellulären Interaktionen hinwies. Die gewichtete Genkorrelationsnetzwerkanalyse identifizierte ein Gen-Koexpressionsmodul, das stark mit der längerfristigen Blutzuckerkontrolle, gemessen durch HbA1c, korreliert. Das Proteom-Profiling deckte eine herausragende Ähnlichkeit zwischen den Proteomen der ND-Inseln und eine bemerkenswerte Streuung der T2D-Proben auf. Die Ergebnisse der differenziellen Abundanzanalyse sowie der anschließenden Anreicherungsanalysen bestätigten weitgehend die Ergebnisse der Transkriptomanalyse, obwohl die Korrelation zwischen den Transkriptomen und Proteomen insgesamt gering war. Dennoch wurden einige der interessanten Targets, die in der Transkriptomanalyse identifiziert wurden, wie z.B. ALDOB oder ACADS, durch die Proteomanalyse bestätigt, wobei zusätzliche Targets neu identifiziert wurden (z.B. CD90). Obwohl die aus den Methylierungssequenzierungsexperimenten gewonnenen Informationen höchstwahrscheinlich aufgrund der relativ geringen Anzahl der untersuchten Personen begrenzt sind, konnten dennoch aussagekräftige Beobachtungen gemacht werden. Das eindeutige Vorherrschen hypomethylierter Regionen in T2D-Inseln unterstützt die durch die anderen Analysen gewonnenen Erkenntnisse und unterstreicht die scheinbar unselektive Lockerung der Zügel bei der Genexpression, die zuvor angenommen wurde. Ausgewählte Targets aus den oben erwähnten bioinformatischen Analysen wurden in vitro untersucht, um ihre Rolle in der Betazellbiologie in T2D zu validieren. Die Überexpression von ALDOB unter in vitro Bedingungen ergab keinen dramatischen Phänotyp, und diese Ergebnisse können bestenfalls als Hinweise auf die Richtung der Stoffwechselstörung in Betazellen in T2D interpretiert werden. Insbesondere scheint die Histonacetylierung in T2D überzeugend verändert zu sein, was möglicherweise auf den veränderten Spiegel von ACADS und/oder seinem Paralogon ACADSB zurückzuführen ist und im Einklang mit der beobachteten allgemeinen Hochregulierung der Genexpression in T2D steht. Wichtig ist, dass Immunfluoreszenzexperimente, bei denen die CD90-Expression vollständig außerhalb des endokrinen Zellbereichs identifiziert wurde, die Bedeutung von Validierungsbemühungen in Verbindung mit omics-Experimenten zur Vermeidung von Interpretationen auf der Grundlage falsch positiver Ergebnisse hervorheben. Schließlich wurden Gewebeschnitte einer Untergruppe von Patienten, die durch RNA-Sequenzierung profiliert worden waren, mit einer maßgeschneiderten Bildanalyse-Pipeline auf das Vorhandensein von Insel-Amyloidose untersucht. Diese Daten wurden mit den klinischen Daten und mit einmalig verfügbaren transkriptomischen Profilen integriert. Sowohl die differentielle Expressionsanalyse als auch die GSEA identifizierten Signaturen, die im Zusammenhang mit der Inselamyloidose von Interesse sind (Zytokinrezeptorinteraktion, Proteintranslation und -verarbeitung). Diese Befunde sind jedoch nur begrenzt spezifisch für die Insel-Amyloidose, da sie meist auch in der Hauptanalyse zum Diabetes-Status zu finden sind. Die Identifizierung von traskriptomischen Veränderungen, die spezifisch für die Inselamyloidose sind und nicht direkt mit der Krankheit selbst zusammenhängen, ist daher mit dem derzeitigen Ansatz fraglich. Nichtsdestotrotz wurde ein Gen-Koexpressionsmodul identifiziert, das in signifikanter, wenn auch schwacher Weise mit der Inselamyloidose korreliert, was für künftige Studien zu dieser Entität spricht.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:79428 |
| Date | 09 June 2022 |
| Creators | Barovic, Marko |
| Contributors | Solimena, Michele, Distler, Marius, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | https://doi.org/10.1038/s42255-021-00420-9, info:eu-repo/grantAgreement/European Commission/Innovative Medicines Initiative/115881//RHAPSODY |
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