Bakterielle Infektionen aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κB. Dies trägt sowohl zur Immunantwort, als auch zum Überleben der Wirtszellen bei. In Infektionen mit dem Bakterium Helicobacter pylori stellt diese doppelte Funktion einen mechanistischen Link zwischen der chronischen Entzündung und der Krebsentstehung dar. Für das intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila ist das Überleben der Wirtszelle notwendig für die Vermehrung. Bisher sind jedoch bei beiden Infektionen die Signalwege, die zur NF-κB-Aktivierung führen, nicht ausreichend untersucht. Um NF-κB analysieren zu können, wurden hier monoklonale Zelllinien hergestellt, die ein Fusionsprotein der NF-κB-Untereinheit p65 mit GFP stabil exprimieren. Die Kerntranslokation von p65-GFP kann mit Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert und mit automatischer Bildanalyse quantifiziert werden. Mit dieser Methode konnte zum ersten Mal eine durch ein Bakterium induzierte Oszillation von p65-GFP gezeigt werden. In einem RNAi-basierten Hochdurchsatzscreen wurde diese Methode eingesetzt um neue Faktoren im NF-κB-Signalweg zu identifizieren. Dabei wurde die Infektion mit H. pylori mit den Induktoren TNFα und IL-1β verglichen. Insgesamt wurden 24 Regulatoren identifiziert. Die Identifikation dieser Faktoren vertieft nicht nur unser Verständnis des NF-κB-Signalweges, sondern bietet auch neue molekulare Ziele für mögliche zukünftige Therapien. Bei der detaillierten Analyse der L. pneumophila-induzierten NF-κB-Aktivierung konnte ein einzigartiger, zwei-phasiger Ablauf gezeigt werden. Zunächst verursachte bakterielles Flagellin eine starke, aber kurze Aktivierung. Später war p65 dauerhaft über Stunden im Kern lokalisiert, was eng an die Replikation der Bakterien gekoppelt war. Da die kontinuierliche Kernlokalisation für Transkriptionsfaktoren der NF-κB Familie sehr ungewöhnlich ist, könnte dies ein Hinweis für eine Manipulation durch das Bakterium sein, um das Überleben der Wirtszelle zu sichern. / Infection with pathogens leads to activation of the transcription factor NF-κB. This contributes both to the immune response as well as survival of host cells. In infection with the bacterium Helicobacter pylori, this dual function provides a mechanistic link between the chronic inflammation and cancer development. In infection with the intracellular pathogen Legionella pneumophila, the survival oft he host cell is necessary for replication. However, in both infections, the signaling pathways leading to NF-κB activation are not well understood. Here, in order to investigate NF-κB activation, monoclonal cell lines were generated that stably express the NF-κB subunit p65 fused to GFP. Nuclear translocation of p65-GFP can be visualized by fluorescence microscopy and quantified by software-based picture analysis. Using this technology, oscillations of p65-GFP nuclear translocation could be shown after H. pylori infection. To identify new factors important for NF-κB activation, the new assay was used to conduct an RNAi-based screen. In the screen, infection with H. pylori was compared to induction with the cytokines TNFα and IL-1β. In total, 24 key regulators for NF-κB were identified. The identification of these factors broadens our understanding of NF-κB signaling and could provide targets for future therapies. Finally, detailed observation of NF-κB activation induced by L. pneumophila in single cells revealed a unique, biphasic NF-κB activation. During the first hours, bacterial flagellin induced strong but transient activation. Then, p65 translocated continuously to the nucleus over hours without oscillation. Testing an array of bacterial mutants, a tight link between bacterial replication and continuous NF-κB activation could be shown. Because this continuous nuclear localization is very unusual for a transcription factor of the NF-κB family, this indicates that L. pneumophila could manipulate NF-κB to ensure host cell survival.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16591 |
| Date | 21 July 2009 |
| Creators | Bartfeld, Sina |
| Contributors | Meyer, Thomas F., Uckert, Wolfgang, Scheidereit, Claus |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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