Alternatives Spleißen ist von großer Bedeutung für die Steuerung der Genexpression und Proteindiversität. Die Cdc2-like Kinasen (Clk) und DNA Topoisomerase I (DNA topo I) steuern alternatives Spleißen über die Phosphorylierung von Serine/Arginin-reichen (SR) Proteinen. Tissue Factor (TF) und die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) beeinflussen maßgeblich die Endothelfunktion. Alternatives Spleißen führt zur Bildung von Isoformen von TF („full length“ (fl)TF, alternativ gespleißter humaner (asH)TF) und eNOS (eNOS, eNOS 13A, B und C). Wie das alternative Spleißen von TF und eNOS gesteuert wird und welchen Einfluss dies auf die Endothelfunktion hat ist unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Die TNF-a-Stimulation der HUVEC erhöhte die Expression beider TF-Isoformen. Die Clk-Inhibition reduzierte die mRNA-Expression von flTF und asHTF. Die DNA topo I-Inhibition erhöhte die asHTF-Expression und verringerte flTF. Die Inhibition der DNA topo I reduzierte ebenfalls die Expression des flTF-Proteins aber nicht von asHTF, verbunden mit einer reduzierten TF-Aktivität. Die Clk-Inhibition reduzierte das flTF-Protein und die TF-Aktivität nur leicht aber asHTF vollständig. Die Inhibition der Kinasen beeinflusste das SR Protein-Phosphorylierungsmuster. Die Inhibition von SF2/ASF und SRp75 mittels siRNAs veränderte die Expression und die Aktivität von TF in HUVEC. Die TNF-a-Stimulation von HUVEC induzierte ferner die mRNA-Expression von eNOS 13A, B und C, nicht aber von eNOS. Dies führte zu einer Reduktion der eNOS-Aktivität. Die Inhibition der DNA topo I, nicht aber der Clks hob diese Effekte auf. Diese Daten zeigen, dass die DNA topo I sowie die Clks an der Regulation der endothelialen TF-Expression und Aktivität beteiligt sind, während die eNOS-Isoformexpression und Aktivität nur durch die DNA topo I beeinflusst wurde.Diese Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation des alternativen Spleißens von TF und eNOS sowie dessen Einfluss auf die Endothelfunktion. / Alternative splicing is an important mechanism to control gene expression and protein diversity. The Cdc2-like kinases (Clk) and DNA topoisomerase I (DNA topo I) control alternative splicing by regulating the phosphorylation state of serine/arginine-rich (SR) proteins. Tissue Factor (TF) and the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) are crucial for the endothelial function. Alternative splicing lead to the formation of different isoforms of TF („full length“ (fl)TF, alternatively spliced human (asH)TF) and eNOS (eNOS, eNOS 13A, B and C). How alternative splicing of TF and eNOS is regulated as well as the impact on endothelial function is still unknown and was investigated in this study. The stimulation of HUVEC with TNF-a induced the expression of both TF isoforms. The inhibition of Clks reduced the mRNA expression of flTF and asHTF. DNA topo I inhibition increased asHTF and reduced flTF mRNA expression. Inhibition of DNA topo I also reduced flTF but not asHTF on protein level in stimulated cells leading to a reduced TF activity. Clk-inhibition slightly reduced flTF protein and TF activity, whereas asHTF was completely blocked. The inhibition of both kinases altered the phosphorylation pattern of SR proteins. The siRNA-mediated inhibition of SF2/ASF and SRp75 modified the TF isoform expression and TF activity in TNF-a-induced HUVEC. Moreover, stimulation of HUVEC with TNF-a induced the mRNA expression of eNOS 13A, B and C, but not of eNOS. This led to a reduction of eNOS activity. The inhibition of DNA topo I but not of Clks abolished these TNF-a-mediated effects in HUVEC. These data indicate DNA topo I and the Clks to be involved in the regulation of endothelial TF expression and activity, whereas, eNOS isoform expression and activity was influenced by DNA topo I, but not Clks in TNF-a-stimulated HUVEC. In conclusion, this study reveals new insights into the regulation of alternative splicing of TF and eNOS and the impact of these processes on endothelial function.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16680 |
| Date | 18 November 2009 |
| Creators | Eisenreich, Andreas |
| Contributors | Rauch-Kröhnert, Ursula, Börner, Thomas, Dubiel, Wolfgang |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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