Com a ampla disseminação da AIDS, uma grande gama de microrganismos
tem aparecido como patógenos emergentes, causando importantes infecções em
pacientes imunocomprometidos. Por exemplo, Rhodococcus equi, um agente incomum
de infecções em humanos, tem sido isolado em pacientes imunocomprometidos. A
presença deste microrganismo oportunista em produtos farmacêuticos não tem tido
considerável atenção. No presente trabalho, o método de reação em cadeia da
polimerase (PCR) foi comparado com métodos convencionais para rápida detecção de
três espécies bacterianas em amostras de cremes tópicos contaminadas artificialmente.
As amostras foram incubadas por 24 horas a 37ºC. Depois da incubação em caldo com
10% de tween 20, amostras foram semeadas em meio para crescimento seletivo.
Identificação bioquímica de Bacillus cereus e Rhodococus equi foram feitas utilizando o
sistemas de identificação API 20E® e API Coryne®, respectivamente. Para identificação
de Micrococcus luteus foram utilizados os testes de catalase, oxidase, morfologias das
colônias e o sistema Gram. O DNA foi extraído usando o método do fenol-clorofórmio.
Os iniciadores utilizados contendo a seqüência específica foram para B. cereus (BC1 e
BC2), R. equi (COX-F e COX-R) e para M. luteus (ML-ISR-R e ML-ISR-F) foram
utilizados na reação de PCR. Para validação da metodologia molecular, as seqüências
dos produtos de PCR foram determinadas e analizadas utilizando-se os programas
Blastn e Blastx. Foi observado uma alta similaridade (E .value 0,0) e uma alta
identidade ( > 99%) para as bactérias utilizadas neste estudo. Os métodos convencional
e de PCR detectaram B. cereus, R. equi e M. luteus em todas as amostras
contaminadas artificialmente. O tempo para completar o método de PCR incluindo o
preparo de amostras e a amplificação específica do DNA bacteriano foi de 27 horas.
Para o método convencional foi necessário de 72 a 96 horas para o isolamento e
identificação bioquímica dos microrganismos pesquisados. A rápida detecção de PCR
para B. cereus, R. equi e M. luteus mostrada neste trabalho sugerem o uso desta
metodologia em controle de qualidade microbiológica de produtos tópicos não estéreis,
especialmente utilizados por pacientes imunocomprometidos. / With the ample dissemination of the AIDS, a wide range microorganisms has
blunted as emergent pathogens, causing important infection in immunocompromised
patients. For example, Rhodococcus equi, an unusual cause of infection in humans, has
been isolated from HIV-infected patients. The presence of these opportunistic
microorganisms in pharmaceutical products has not receiv considerable attention. In the
present work PCR assay were compared with standard microbiological methods for
rapid detection of three bacterial species from artificially contaminated sample of topical
creams. Artificially contaminated samples were incubated for 24 horas at 37º C. After
incubation in broth with 10% tween 20, samples were streaked on seletive growth
media. Biochemical identification of Bacillus cereus and R. equi was performed using
API 20E® and API Coryne® identification systems, respectivelly. For Micrococcus luteus
identification, colony an Gram-stained morphology of the bacterium and the biochemical
tests of catalase and oxidase were used.DNA was extracted using phenol-chloroform
method. DNA primers containing the specific sequences of the BC1 and BC2 for B.
cereus, COX-R and COX-F for R. equi and ML-ISR-F and ML-ISR-F for M. luteus were
used for detection in the PCR reaction. In order to validate this methodology, DNA
sequences of the products were determined. The sequences of the cloned PCR
products were analysed using Blastn and Blastx programs. It was observed a marked
similarity (E.value 0,0) and a high identity (> 99%) to the bacteria used in the study.
Both the PCR and the standard enrichment tests method detected B. cereus, R. equi
and M. luteus in all of the deliberately contaminated samples. The time to complete the
PCR assay including sample preparation and PCR amplification of the specific DNA
bacterial targets was 27 h. Standard plating methods required 72-96 h for the bacteria
to be isolated, purified and biochemecally identified. Rapid PCR detection of B. cereus,
R. equi and M. luteus showed in this work suggests the use of this methodology in the
microbiology control of non-sterile topical products, specially intended for use with
immunocompromised patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/745 |
| Date | 19 November 2007 |
| Creators | VIEIRA, Daniela Cristina de Macedo |
| Contributors | SILVA, Paulo Márcio Faria e, http://lattes.cnpq.br/7630230928263742, MARQUES, Marcos José, SALGADO, Hérida Regina Nunes |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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