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Previous issue date: 2016 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) / Micro-organismos resistentes a antibi?ticos v?m atingindo ?ndices elevados nos ?ltimos anos, agravando problemas de sa?de p?blica e econ?micos. O impacto na sociedade devido ? resist?ncia de bact?rias aos antibi?ticos convencionais tem mobilizado a pesquisa para o desenvolvimento de novas drogas. Nesse contexto, surgem os pept?deos antimicrobianos, que s?o mol?culas efetoras do sistema imune inato e podem ser encontrados em praticamente todos os seres vivos. Para prote??o contra os micro-organismos presentes em seu habitat, a pele de anuros apresenta um verdadeiro arsenal qu?mico, constitu?do, em sua maioria, de diferentes classes de pept?deos. Dentre esses, os antimicrobianos s?o considerados os mais avan?ados participantes do sistema imunol?gico.
V?rios estudos sugerem que os pept?deos antimicrobianos podem atuar por diferentes mecanismo como miceliza??o, forma??o de poros na superf?cie da membrana ou, ainda, pelo ataque a algum alvo intracelular. Embora a maioria dos modelos existentes proponham que pept?deos antimicrobianos exercem suas atividades biol?gicas por meio da intera??o com a membrana bacteriana, o mecanismo de a??o dessas mol?culas ainda n?o ? completamente compreendido. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo obter informa??es estruturais, conformacionais e de intera??o em ambientes que mimetizam membranas biol?gicas, do pept?deo Hylaseptina P1 (HSP-1), composto por 14 res?duos de amino?cidos e isolado do anuro da esp?cie Hyla punctata visando o entendimento do seu mecanismo de a??o.
Neste trabalho, o pept?deo HSP-1 foi sintetizado manualmente atrav?s da s?ntese de pept?deos em fase s?lida via estrat?gia Fmoc. As prefer?ncias conformacionais do pept?deo em meios micelares de dodecilsulfato de s?dio (SDS), dodecilfosfocolina (DPC) e ves?culas fosfolip?dicas de 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (PC) e 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (PG) foram avaliadas por Dicro?smo Circular. Observou-se que em meio aquoso HSP-1 adota estrutura desenovelada, enquanto que, em meios micelares e ves?culas fosfolip?dicas, apresentou conforma??o ?-h?lice. A estrutura tridimensional foi estudada na presen?a de micelas de SDS e DPC por Espectroscopia de Resson?ncia Magn?tica Nuclear em solu??o, revelando que, em micelas de SDS o pept?deo HSP-1 exibe conforma??o helicoidal mais prolongada do que em micelas de DPC, no qual foi poss?vel verificar pequena dobra da h?lice na regi?o N-terminal da cadeia pept?dica, sugerindo maior inser??o do pept?deo em micelas zwiteri?nicas. O efeito da adi??o de pept?deo no tamanho e na carga superficial de ves?culas fosfolip?dicas de PC e PC:PG (3:1) foi investigado por medidas de espalhamento de luz din?mica e Potencial Zeta. Verificou-se que a adi??o de HSP-1 resulta no aumento do di?metro hidrodin?mico (?Dh ? 20 nm) e aumento do potencial Zeta (?? ? 15 mV) de ves?culas unilamelares (LUV?s) de PC:PG, indicando intera??o eletrost?tica com a superf?cie das ves?culas. Quando ves?culas de PC foram tituladas com HSP-1, foi observada maior altera??o no di?metro hidrodin?mico das LUVs (?Dh ? 22 nm), enquanto que n?o se observaram altera??es significativas nos valores de potencial Zeta (?? ? 0 mV), sendo indicativo de uma maior inser??o do pept?deo em membranas zwiteri?nicas. Conforme observado nos resultados de Calorimetria de Titula??o Isot?rmica, a intera??o com ves?culas zwiteri?nicas foi da ordem de 102 maior do que o valor encontrado para intera??o com ves?culas negativas. Contudo, os dados termodin?micos revelaram a predomin?ncia de intera??es eletrost?ticas de HSP-1 com ves?culas de PC:PG e hidrof?bicas com ves?culas de PG. Finalmente, a capacidade de forma??o de poros de HSP-1 foi examinada por meio de medidas de extravasamento de carboxifluoresce?na (CF) em ves?culas de PC e PC:PG. Em PC-LUVs observou-se uma maior intensidade de fluoresc?ncia em compara??o com PC:PG-LUVs, sugerindo uma maior atividade l?tica do pept?deo em ves?culas zwiteri?nicas. A porcentagem m?xima de CF liberada foi superior em LUVs-PC (65%) quando comparado a LUVs de PC:PG (50%), confirmando que HSP-1 tem maior capacidade de permeabiliza??o em meio zwiteri?nico. Os dados de extravasamento demostraram tamb?m menor cin?tica de libera??o de CF em PC-LUVs, condizente com um mecanismo no qual h? maior inser??o do pept?deo na interface da bicamada lip?dica, e maior cin?tica de libera??o de CF em PC:PG-LUVs, de acordo com um mecanismo tipo carpete, o qual envolve apenas intera??o superficial do pept?deo com a membrana. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2016. / The resistance of microorganisms to antibiotics have reached high levels in recent years, exacerbating public health and economic problems. The impact of bacterial resistance on the global society has mobilized the research community for the development and new drugs discovery. In this context, antimicrobial peptides appear as an alternative antibiotics class, which are effector molecules of the innate immune system in almost every living beings. In order to protect against microorganisms present in their habitat the skin of frogs presents a real chemical arsenal consisting mostly of different peptides classes, which are considered the most advanced participants of the immune system.
Several studies suggest that antimicrobial peptides may act by different models such as micellization, pore formation in membrane surface or also intracellular target attack. Although most of models propose that antimicrobial peptides exert their biological activities by interacting with the bacterial membrane, the mechanism of action is not still fully understood. In order to study the action mechanism of antimicrobial peptide Hylaseptina P1 (HSP-1), composed of 14 amino acid residues and isolated from Hyla punctate species, this work presents conformational and thermodynamic analysis of peptide-membrane interaction in biomimetic environments.
In this work, the HSP-1 peptide was synthesized manually by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy. The conformational preferences of peptide were evaluated by Circular dichroism in sodium dodecylsulfate (SDS) and dodecilfosfocolina (DPC) micellar media or 1-palmitoyl-2-oleilfosfatidilcolina (PC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol (PG) phospholipid vesicles. A random conformation was observed to HSP-1 in aqueous medium while in micellar or phospholipid vesicles media HSP-1 showed a predominant ?-helix conformation. The three dimensional structure were obtained by solution Nuclear Magnetic Resonance in the presence of SDS and DPC micelles, revealing that HSP-1 exhibits a longer helical conformation in SDS than DPC micelles. In zwiterionic medium could be verified a subtle bend at the N-terminus, suggesting a partial insertion of the peptide in DPC micelles.
The effects of adding peptide in size or surface charge of PC and PC:PG phospholipid vesicles were investigated by Dynamic Light Scattering and Zeta Potential measurements. The addition of HSP-1 to PC:PG-LUVs results in increasing of both hydrodynamic diameter (?Dh ? 20 nm) and zeta potential (?? ? 15 mV), indicating an electrostatic interaction with the surface vesicles. On the other hand, when PC-LUVs were titrated with HSP-1 a greater change in hydrodynamic diameter (?Dh ? 22 nm), no significant variations were observed in superficial charge, indicating a partial insertion of the peptide in zwitterionic PC membranes. In addition, the thermodynamic studies carried out by isothermal titration calorimetry showed a peptide-membrane interaction approximately 102 higher with PC-LUVs when compared to negative PC:PG-LUVs. Nevertheless, whereas the greater enthalpic contribution in PC:PG-LUVs revealed the predominance of electrostatic interactions with HSP-1, in PC vesicles predominate hydrophobic interactions. Finally, the ability of poring formation of HSP-1 was examined by carboxyfluorescein (CF) release from PC and PC:PG vesicles. It was observed a higher fluorescence intensity in PC-LUVs compared to PC:PG-LUVs, suggesting a greater lytic activity of the peptide in zwiterionic vesicles. The maximum percentage of CF released was approximately 65% to PC-LUVs and 50% to PC:PG-LUVs, confirming a greater membrane permeabilization in zwiterionic medium. Furthermore, this study has also demonstrated a lesser kinetics of CF leakage in PC-LUVs, consistent with a mechanism in which there is greater insertion of the peptide in the lipid bilayer interface. On the other hand, the higher kinetics of CF leakage in PC:PG?LUVs is in accordance with a carpet-like mechanism, which involve only superficial interaction between peptide and membrane.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:acervo.ufvjm.edu.br/jspui:1/1132 |
| Date | 03 1900 |
| Creators | Gomes, Isabela Pereira |
| Contributors | Verly, Rodrigo Moreira, Magalh?es, Mariana Quezado de, Nelson, David Lee, Resende, Jarbas Magalh?es, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), Verly, Rodrigo Moreira |
| Publisher | UFVJM |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFVJM, instname:Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, instacron:UFVJM |
| Rights | An error occurred getting the license - uri., A concess?o da licen?a deste item refere-se ao ? termo de autoriza??o impresso assinado pelo autor, assim como na licen?a Creative Commons, com as seguintes condi??es: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publica??o, autorizo a Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri e o IBICT a disponibilizar por meio de seus reposit?rios, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei n? 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permiss?es assinaladas, para fins de leitura, impress?o e/ou download, a t?tulo de divulga??o da produ??o cient?fica brasileira, e preserva??o, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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