Orientador : Profª Drª Nadia Krieger / Co-orientadores : Profª Drª Gisella Maria Zanin / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 04/05/2015 / Inclui referências : f. 140-158 / Resumo: Neste trabalho, uma nova lipase isolada de uma biblioteca metagenômica, LipC12, foi imobilizada e sua aplicação na síntese de ésteres foi estudada. Inicialmente, LipC12, que contém uma cauda composta de 6 histidinas (cauda His) em sua estrutura, foi purificada em coluna de níquel e imobilizada por adsorção em polipropileno em pó (Accurel MP-1000) e em sílica em pó (Celite 545), e por ligação covalente em um copolímero acrílico (Immobead 150) e em uma membrana de polipropileno funcionalizada com glutaraldeído. Preparações com cargas de proteína de 10 mg g-1 (proteína/suporte) foram utilizadas na síntese do oleato de etila em n-hexano, utilizando etanol e ácido oleico numa razão molar (RM) de 3:1. LipC12 imobilizada no Immobead 150 proporcionou uma maior conversão em éster (95% em 4 h). Isto levou à investigação da imobilização de LipC12 diretamente do extrato bruto (EB) no Accurel MP-1000 e Immobead 150. No entanto, Accurel MP-1000 não proporcionou imobilização seletiva de LipC12, sendo a eficiência de imobilização (E) muito baixa (29%), provavelmente devido à imobilização de outras proteínas do EB no suporte. Estudos de saturação do suporte Immobead revelaram que, com carga de proteína de 200 mg g-1 de suporte, o preparado imobilizado (Ibead-EBLipC12) utilizado na síntese do oleato de etila em n-hexano (RM 3:1, 40 °C, 250 rpm) proporcionou conversão em éster de 99% em 60 min. Ibead-EBLipC12 foi reutilizada em 10 ciclos sucessivos de 60 min na mesma reação, obtendo-se conversões acima de 90%. Em seguida, Ibead-EBLipC12 foi utilizada para catalisar reações em sistemas livres de solvente, e na síntese do oleato de etila com RM de 1:1, uma reação modelo para a síntese de ésteres do biodiesel, obteve-se uma conversão de aproximadamente 30%, mas toda a atividade foi perdida em 12 h. No entanto, quando a reação foi repetida com a adição do etanol em seis alíquotas iguais durante a reação, foi encontrada uma conversão em éster de 85% em 48 h. Por outro lado, na síntese do caprilato de etila, um éster de aroma, a conversão foi de apenas 6% após 96 h, mesmo com a adição do etanol em etapas. Na reação de síntese de um lipídio estruturado, utilizando ácido caprílico e azeite de oliva (RM 2:1, 40 °C, 250 rpm) Ibead-LipC12 promoveu a inserção de 23% de ácido caprílico nas posições sn-1 e sn-3 dos triacilgliceróis do azeite de oliva, tornando-o um lipídio estruturado do tipo MLM (ácidos graxos de cadeia média nas posições sn-1,3 e ácido graxo de cadeia longa na posição sn-2). Estes resultados mostram que Ibead-EBLipC12 tem um bom potencial para ser utilizada na síntese enzimática de biodiesel e de lipídios estruturados. Além disso, a possibilidade de imobilizar LipC12 diretamente a partir do extrato bruto de proteínas, evita a necessidade de purificá-la antes da imobilização. Palavras-chave: metagenômica, lipases, LipC12, imobilização, síntese de ésteres, biodiesel, lipídeos estruturados, aromas. / Abstract: In this work, a new metagenomic lipase, LipC12, was immobilized and its characterization and application in the synthesis of esters was studied. Initially, LipC12, which contains a histidine tag (His-tag) in its structure, was purified on a nickel column and immobilized by adsorption on the supports Accurel MP-1000 and Celite 545, and by covalent bonding on Immobead 150 and on a functionalized polypropylene membrane. Preparations obtained with 10 mg of protein per gram of support were compared with respect to the synthesis of ethyl-oleate in n-hexane, using an ethanol to oleic acid molar ratio of 3:1. LipC12 gave a better conversion of oleic acid when immobilized on Immobead 150 (95% in 4 h). This led us to investigate the immobilization of His-tagged LipC12 directly from the crude extract on Immobead 150 and Accurel MP-1000. However, Accurel MP-1000 did not provide selective immobilization of LipC12, and probably due to immobilization of other proteins of the EB in support, the immobilization efficiency (E) was too low. At a protein loading of 200 mg g-1, the immobilized preparation ("Ibead-CELipC12") gave a conversion of oleic acid of 99% in 60 min, for reactions performed in n-hexane (molar ratio 3:1, 40 °C, 250 rpm) and could be reused in successive cycles of 60 min in the same reaction to give conversions above 90%. When Ibead-CELipC12 was used to catalyze the esterification of oleic acid with ethanol in a solvent-free system (standard reaction for the synthesis of esters biodiesel) at an ethanol to oleic acid molar ratio of 1:1, all activity was lost within 12 h, with a conversion of oleic acid of around 30%. However, when the reaction was repeated with the addition of ethanol in six equal aliquots during the course of the reaction, a conversion of oleic acid of 85% in 48 h was achieved. Moreover, in the synthesis of ethyl caprylate, an aroma ester, the conversion was only 6% after 96 h, even with the addition of ethanol in aliquots. In the synthesis of a structured lipid, using caprylic acid and olive oil (molar ratio 2:1, 40 °C, 250 rpm), Ibead-CELipC12 promoted the insertion of 23% of caprylic acid in the sn-1 and sn-3 positions of the triacylglycerols of the olive oil, making it a structured lipid MLM, i.e a triacylglycerol containing medium-chain fatty acids (M) at positions sn-1 and sn-3 and a long-chain fatty acid (L) at position sn-2. These results demonstrate that LipC12 has good potential to be used in the enzymatic synthesis of biodiesel and structured lipids. The results are particularly encouraging because it was possible to immobilize His-tagged LipC12 directly from the crude extract, thereby avoiding the need to purify the enzyme prior to immobilization. Keywords: metagenomic, lipases, LipC12, immobilization, ester synthesis, biodiesel, structured lipids, aroma.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/48434 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Madalozzo, Aline Dutra |
| Contributors | Zanin, Gisella Maria, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica), Krieger, Nadia, 1952- |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 161 f. : il. algumas color., tabs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponivel em formato digital |
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