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Previous issue date: 2009-10-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Trichoderma are anamorphic fungi belonging to the class of Hifomicetos, also called
imperfect fungi, or asexual conidial and whose gender Hypocrea teleomorph. They are
free-living fungi, distributed throughout the world and found in different soil
temperatures, especially those containing organic matter. Usually are not considered
important human pathogens, but there are some reports indicating occasional
pathogenicity of some species. Its easy handling and in vitro, stability and viability of
colonies preserved this kind are a big target for biotechnology research. Because of
these characteristics were isolated Trichoderma from plant Victoria amazonica, Rollinia
sp. Murraya paniculata and Strychnos cogens; wood Scleronema micranthum, known
as cardeiro; jatoba (Hymenaea courbaril), land of cubiu culture (Solanum sessiliflorum)
and Indian black earth, in order to identify the molecular biology, the species level, such
isolates and to assess their ability to produce cellulolytic enzymes. Of the 30 lines
obtained were cultured spore, which were preserved in mineral oil, Castellani and
method in 10% glycerol. From the suspension in glycerol, each sample was inoculated
in 20ml of 10μL BD and cultivated 26oC, 100 rpm for 40:00 h. Next was extracted
genomic DNA, performed PCR of specific regions of the ITS-1 and ITS-2 ribosomal
DNA sequencing and subsequently. For the production of enzymes, the isolates were
first grown in induction medium. Were inoculated 10μL of spore solution (glycerol
10%) in 50 mL of solution Manachini where the substratum was used to
carboxymethylcellulose. The fungi were incubated at 27 ° C, 120 rpm for 120 hours.
The dosage of CMCase was performed using the method of acid Dinitrosalicílico. For
the determination of β-glucosidase was used p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside
(PNPG) as substrate for the enzyme. The total protein concentration was determined by
the Bradford method, using the reagent concentrate commercial Bio-RadTM and bovine
serum albumin (ASB) as standard. The result of molecular identification of the first 13
samples revealed the species: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T.
ovaslisporum, T. hamatum, T. piluliferum and T. koningiopsis, with a percentage
between 96 and 99% identity and 100% reliability. The results indicated CMCase
enzyme to low values, less than 0.100 U / mL with the exception of T. koningii (MPCE
10 3.2), T. harzianum (MPCE 2 2.2a), both isolates of M. paniculata, and isolate 1437
identified as Trichoderma sp., from Indian black earth, which showed slightly higher
levels of 0.112 and 0.103 and 0.105 U / mL, respectively. For β-glucosidase, the results
showed high activity in the vast majority of isolates with emphasis on T. harzianum
MPCE 3 3.1 (10.45 U / mL) and T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9.71 U / mL). All isolates
produced protein in culture medium containing carboxymethylcellulose as substrate
inducer / Trichoderma são fungos anamórficos pertencentes à classe dos hifomicetos, também
chamados fungos imperfeitos, assexuais ou conidiais e que têm como teleomorfo o
gênero Hypocrea. São fungos de vida livre, distribuídos em todo o mundo e encontrados
em solos de diversas temperaturas, especialmente naqueles que contém matéria
orgânica. Geralmente não são considerados importantes patógenos humanos, mas
existem alguns relatos indicando patogenicidade ocasional em algumas espécies. Sua
fácil manipulação e cultivo in vitro, estabilidade e viabilidade das colônias preservadas,
fazem desse gênero um grande alvo para as pesquisas biotecnológicas. Por tais
características, foram isolados Trichoderma das plantas Victoria amazonica, Rollinia
sp., Murraya paniculata e Strychnos cogens; da madeira Scleronema micranthum,
conhecida como cardeiro; de jatobá (Hymenaea courbaril), do solo de cultura de cubiu
(Solanum sessiliflorum) e de terra preta de índio, com o objetivo de identificar, pela
biologia molecular, em nível de espécie, tais isolados, bem como avaliar sua capacidade
de produção de enzimas celulolíticas. Das 30 linhagens obtidas foram realizadas
culturas monospóricas, as quais foram preservadas em óleo mineral, método Castellani
e em glicerol 10%. A partir da suspensão em glicerol, de cada amostra foi inoculado
10μL em 20mL de BD e cultivado a 26oC, a 100 rpm por 40:00h. Em seguida foi
extraído o DNA genômico, deste realizada a PCR específica para as regiões ITS-1 e
ITS-2 do DNA ribossômico e posteriormente o sequenciamento. Para a produção de
enzimas, os isolados foram previamente cultivados em meio indutor. Foram inoculados
10μL da solução de esporos (Glicerol 10%) em 50mL de solução de Manachini onde o
substrato indutor utilizado foi a carboximetilcelulose. Os fungos foram incubados a
27°C, 120 rpm durante 120 horas. A dosagem de CMCase foi efetuada com base no
método do Ácido Dinitrosalicílico. Para a dosagem de β-glucosidase foi utilizado o pnitrofenil-
β-D-Glucopiranosídeo (pNPG) como substrato para a enzima. A concentração
de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford, utilizando-se o reagente
concentrado comercial da Bio-RadTM e albumina de soro bovino (ASB), como padrão.
O resultado da identificação molecular das primeiras 13 amostras nos revelaram as
espécies: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T.
hamatum, T. piluliferum e T. koningiopsis, com um percentual entre 96 e 99% de
identidade e 100% de confiabilidade. Os resultados enzimáticos para CMCase
indicaram valores baixos, inferiores a 0,100 U/mL com exceção de T. koningii (MPCe
10 3.2), T. harzianum (MPCe 2 2.2a), ambos isolados de M. paniculata, e o isolado
1437 identificado como Trichoderma sp., proveniente de terra preta de índio, que
apresentaram valores um pouco mais altos de 0,112 e 0,103 e 0,105 U/mL,
respectivamente. Para β-glucosidase, os resultados apresentados mostraram alta
atividade na grande maioria dos isolados com destaque para T. harzianum MPCe 3
3.1(10,45U/mL) e T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9,71 U/mL). Todos os isolados produziram
proteínas em meio de cultura contendo carboximetilcelulose como substrato indutor
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/2254 |
| Date | 14 October 2009 |
| Creators | Melo, Laryssa da Silva |
| Contributors | Hanada, Rogério Eiji |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, BR, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600 |
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