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Previous issue date: 2017-06-30 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The increase in world cheese production, the scarcity of animal rennet, associated with the
rejection of genetically modified proteases, encourages the search for new sources of milkclotting
enzymes. Among fungi, edible mushrooms have stood out as alternative sources of
peptidases that can be used as milk-clotting. This research aimed to evaluate the synthesis of
proteases by six edible mushrooms from DPUA Culture Collection and select a milk-clotting
producer species with physicochemical characteristics for cheese production. The submerged
fermentation was carried out in GYP medium (glucose, yeast extract and peptone) with 0.5%
(w/v) of gelatine. The edible mushroom that produced proteases with higher coagulant ratio in
the liquid medium was cultivated in Amazon agroindustrial wastes as substrate: angelim
sawdust, cupuaçu, exocarp of tucumã, banana leaf and açai seeds, supplemented with rice bran.
The proteolytic activity was determined using 1% (w/v) of azocasein as substrate and the
determinination of milk-clotting activity was used 10% (w/v) of skimmed milk solution as
substrate. Some parameters were used to evaluate the influence of milk-clotting enzymes
production (pH of the culture medium, fermentation time, size and age of the inoculum). The
enzymes were characterized according to optimums pH and temperature, pH and temperature
stabilities, and effect of metallic ions and inhibitors. The cytotoxic effect of the selected
mushroom crude extract was evaluated in human MRC-5 fibroblast. The analysis of centesimal
and microbiological composition was determined in the elaborated cheese. In submerged
fermentation conditions, Pleurotus albidus was the best protease producer (34.00 U/mL) and
the synthesis of theses enzymes were stimulated by culture age (10 days) e inoculum volume
[5% (p/v)]. The enzymes showed optimum activities at pH 5 and 60°C, with stabilies at pH 5
to 8 and 30°C to 60°C, being classified as cysteine and serine proteases. The milk-clotting
enzymes from Pleurotus albidus expressed the highest coagulant ratio (21.60) with maximum
activity at 60 °C and pH 6. Iodoacetic acid was the inhibitor of higher action in the proteolytic
activity suggesting the presence of cysteine proteases. Pleurotus albidus milk-clotting enzymes
showed no toxicity against human fibroblasts (MRC5). In the solid fermentation, Pleurotus
albidus presented high enzyme production in the mixture composed by açai seeds and rice bran
(90:10, w/w). The milk-clotting enzymes demonstrated coagulant ratio of 14.58, abundant whey
formation and strong coagulation in milk solution. The best conditions to milk-clotting enzymes
production were: inoculum with 10 days of age, culture medium at pH 6 and inoculum size of
2.5% (p/v). The enzymes exhibited maximum catalytic activity at pH 5 and 55 ° C with stability
until 45°C. They were completely inhibited by iodoacetic acid. The cheese produced with
Pleurotus albidus milk-clotting enzymes as coagulant agent demonstrated contents of moisture,
lipid and protein of 55%, 20% and 18%, respectively. The microbiological analysis showed that
the cheese was under the standards required by Brazilian legislation. Pleurotus albidus is a
potential source of coagulant that can be applied in dairy industry, especially in the manufacture
of cheese. / O aumento da produção mundial de queijos, a escassez do coalho animal e a rejeição de
proteases geneticamente modificadas, incentiva a busca por novas fontes de coagulantes do
leite. Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como fonte alternativa de peptidases
coagulantes para aplicação na indústria de laticínios. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar
a síntese de proteases por seis cogumelos do acervo da Coleção de Culturas DPUA para
selecionar uma espécie produtora de coagulante com características físico-químicas para
elaboração de queijo. A fermentação em meio líquido foi realizada em GYP [(20 g de glicose,
5 g de extrato de levedura, 15 g de peptona/1000 mL de água)], com 0,5 % de gelatina (p/v). O
macrofungo produtor de proteases com elevada razão coagulante, em meio líquido, foi
cultivado em resíduos lignocelulósicos amazônicos: serragem de angelim, exocarpos de
cupuaçu e tucumã, engaço de banana e semente de açaí, suplementados com farelo de arroz. As
atividades proteolítica e coagulante foram determinadas utilizando como substratos azocaseína
1% (p/v) e leite desnatado em pó a 10% (p/v), respectivamente. Os parâmetros que influenciam
a produção de coagulantes (pH do meio de cultivo, tempo de fermentação, tamanho e idade do
inóculo) foram avaliados. O coagulante foi caracterizado quanto ao pH e temperatura ótimos,
estabilidade ao pH e à temperatura, e efeito de íons metálicos e inibidores. A citotoxicidade do
coagulante foi avaliada em fibroblastos humanos MRC-5. No queijo elaborado com o
coagulante foi determinada a composição centesimal e a microbiológica. Na fermentação
submersa, Pleurotus albidus foi o produtor significativo de proteases (34,00 U/mL) e a síntese
dessas enzimas foi estimulada pela idade (10 dias) e volume do inóculo (5%, p/v). As proteases
mostraram atividade ótima em pH 5 a 60°C, estabilidade em pH (5-8), temperatura de 30°C até
60°C, sendo classificadas como cisteíno e serinoproteases. O coagulante de Pleurotus albidus
expressou razão coagulante de 21,60 com máxima atividade a 60 °C, pH 6. Ácido iodoacético
inibiu significativamente a atividade coagulante, sugerindo maior quantitativo de
cisteínoproteases. As enzimas de Pleurotus albidus não apresentaram toxicidade contra
fibroblastos humanos (MRC5). Em matriz sólida, Pleurotus albidus cultivado em semente de
açaí e farelo de arroz (90:10, p/p) produziu protease com elevada razão coagulante (14,58),
formação de soro abundante e forte coagulação. As condições ideais para produção do
coagulante foram: inóculo (10 dias de idade), meio de cultivo pH 6, tamanho do inóculo (2,5%,
p/v) e idade do inóculo 10 dias. O coagulante exibiu máxima atividade em pH 5, a 55 °C, com
estabilidade até 45 °C, sendo inibido por ácido iodoacético. O quejo elaborado apresentou
umidade (55%), lipídios (20%), proteínas (18%) e atendeu aos padrões microbiológicos
exigidos pela legislação brasileira. Pleurotus albidus é uma fonte de coagulante que pode ser
aplicada na indústria de laticinios, em especial na fabricação de queijo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5897 |
| Date | 30 June 2017 |
| Creators | Martim, Salomão Rocha, 92-99138-7544 |
| Contributors | ppgbiotec@ufam.edu.br, Teixeira, Maria Francisca Simas |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Amazônia Legal - BIONORTE, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
| Relation | 1984485651082134923, 500 |
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