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Previous issue date: 2016-04-19 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Chikungunya virus (CHIKV) is an RNA virus (family Togaviridae, genus Alphavirus) transmitted to humans through the bite of female mosquitoes Aedes aegypti and Aedes albopictus. The clinical onset in CHIKV infection is most often characterized by fever and joint pain, and so far there is no specific antiviral therapy or vaccine for the treatment of the infection. The diagnosis of CHIKV infection is based on clinical and laboratory findings, with the latter being performed by virus isolation, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), serology, and rapid tests: To produce a recombinant antigen through the cloning and expression of the capsid protein (C) of CHIKV in order to detect anti-CHIKV antibodies in human serum samples by immunoenzymatic assay. A synthetic gene (gBlock), specifically designed for this study, corresponding to the protein C (400 base pair) of Chikungunya virus, was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then cloned into pGEM-T Easy system-Escherichia coli. The transformant clones were sequenced, and recombinant products were digested using the restriction endonucleases EcoRI and BamHI, and then subcloned and expressed in the vector pET-23a+ Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant protein C expression and the molecular weight were determined by SDS-PAGE and Dot Blot and purified by affinity chromatography using nickel column. A immunoenzymatic assay was performed using the recombinant antigen to detect IgM and IgG antibodies in sera from patients with CHIKV infection confirmed by the National Reference Laboratory of the Ministry of Health, as well as sera from patients tested positive for Mayaro virus, Dengue virus and Cytomegalovirus infection. The derived recombinant protein showed size and antigenicity compatible with the native protein C from the CHIKV; a concentration of 0.342 ng/mL of recombinant protein C was obtained using the pET-23a+ E. coli BL21 (DE3); the affinity chromatography using nickel column was effective to obtain the soluble protein C, confirmed by the Bradford method; the immunoenzymatic assay using the recombinant antigen showed cross-reactivity to others Alphavirus pathogens. The results indicate that the expression system pET-23a+ E. coli BL21 (DE3) was effective to produce the recombinant protein C of CHIKV, however the antigen was not sensitive enough to detect only the CHIKV infection. / O vírus Chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA (família Togaviridae, gênero Alphavirus), transmitido aos seres humanos através da picada de mosquitos fêmeas de Aedes aegypti e Aedes albopictus. O início das manifestações clínicas da infecção por CHIKV na maioria das vezes é caracterizada por febre e dor nas articulações, e até agora não existe uma terapia antiviral específico ou vacina para o tratamento da infecção. O diagnóstico da infecção CHIKV é baseado em achados clínicos e laboratoriais, com o último sendo realizada por isolamento do vírus, transcrição reversa-polimerase reação em cadeia (RT-PCR), sorologia e testes rápidos. Para produzir um antígeno recombinante através da clonagem e expressão da proteína do capsídeo (C) de CHIKV de modo a detectar anticorpos anti-CHIKV em amostras de soro humano, por ensaio imunoenzimático. Um gene sintético (gBlock), especificamente concebidos para esse estudo, correspondente à proteína C do capsídeo (400 pares de bases) do vírus Chikungunya, foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e, em seguida, clonado em pGEM-T Easy sistema de Escherichia coli. Os clones transformantes foram sequenciados, e os produtos recombinantes foram digeridos com as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI, e depois subclonado e expresso no vector pET-23a+ e Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína C recombinante e o peso molecular foram determinados por SDS-PAGE e Dot Blot e purificado por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de níquel. Um ensaio imunoenzimático foi realizada utilizando o antígeno recombinante para detecção de anticorpos IgM e IgG em soros de pacientes com infecção CHIKV confirmados pelo laboratório nacional de referência do Ministério da Saúde, bem como soros de pacientes positivos para o vírus Mayaro, vírus da dengue e citomegalovírus infecção. O derivado da proteína recombinante mostrou tamanho e antigenicidade compatível com a proteína C nativa do CHIKV; uma concentração de 0,342 ng / mL de proteína C recombinante foi obtido utilizando o pET-23a+ de E. coli BL21 (DE3); a cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de níquel foi eficaz para obter a proteína C solúvel, confirmada pelo método de Bradford; o ensaio imunoenzimático utilizando o antígeno recombinante mostrou reatividade cruzada com outros agentes patogénicos de Aphavírus. Os resultados indicam que o sistema de expressão pET-23a+ de E. coli BL21 (DE3) foi eficaz para produzir a proteína C recombinante de CHIKV, no entanto, o antígeno não foi suficientemente sensível para detectar apenas a infecção CHIKV.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5951 |
| Date | 19 April 2016 |
| Creators | Fernandes, Alana Batista, 92-98197-7160 |
| Contributors | ppgbiotec@ufam.edu.br, Oliveira, Cintia Mara Costa de, Tanury, Almícar |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600, 500, 1984485651082134923 |
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